| 研究課題/領域番号 |
18H06149
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
0803:病理病態学、感染・免疫学およびその関連分野
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
池田 美恵 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 博士研究員 (40734314)
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| 研究期間 (年度) |
2018-08-24 – 2020-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2018年度)
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| 配分額 *注記 |
2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2018年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | アルテミシニン / 核蛍光 / ミトコンドリア蛍光 / FACS / RSA / 死原虫 / アルテミシニン耐性 / 熱帯熱マラリア原虫 / Pyknotic / 定量検査 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、ウガンダのマラリア感染患者から得た凍結血液検体からの培養株樹立およびマラリア原虫生死判定法の検討を実施した。凍結血液検体は、12% NaCl溶液および1.6% NaCl溶液を用いて解凍した。薄層ギムザ染色標本によって原虫の増殖を確認、原虫感染率1%以上での継代培養が3回以上となった時点で、限界希釈法によってクローン化を実施した。また、ウガンダのアルテミシニン(ART)耐性原虫も同様に解凍し、培養を実施した。耐性原虫はKelch13遺伝子に変異を持っている。この変異をマーカーとして継代中の原虫を確認したところ、ART耐性原虫が減少していくことが分かった。ARTを添加した培養系を用いて耐性原虫のみを得る必要があり、そのための培養系を現在検討している。
マラリア原虫生死判定のために、ミトコンドリア蛍光(Mitotracker Red CMXRos）と核蛍光(SYBR Green I)をマーカーとして、Fluorescence activated-cell sorting（FACS)による測定条件の検討を行った。それぞれの蛍光試薬の希釈系列を作成し、非感染赤血球と感染赤血球の測定値の差が最も大きい濃度を最適濃度と設定した。検討の結果、ミトコンドリアでは12.5nM、核では0.0125xの濃度が最適濃度となった。この濃度の有効性をRSAサンプルの生存原虫測定によって検証したところ、FACSでの生存原虫検出率がギムザ染色の1/8-1/16倍であり、FACSの検出率が低かった。原虫のミトコンドリアは発達段階によってサイズが異なり、特に感染初期のearly ring-formではミトコンドリアを十分に染色出来ない可能性が考えられる。ミトコンドリアでの染色条件の検討を続けるとともに死原虫(Pyknotic)核のみをDAPIで検出する方法も検討している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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