| 研究課題/領域番号 |
18J01017
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
生体関連化学
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
竹之内 修 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2020年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2019年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2018年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | chromosome / CRISPR / machine learning / meiosis / oocyte / dCas / labeling / chromosome segregation / 染色体 / 染色体分配 / 卵母細胞 / イメージング / 老化 / 微小管 / 紡錘体 / 減数分裂 / DNA標識 / ライブイメージング / 光遺伝学 / 分子プローブ |
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| 研究実績の概要 |
【CRISPR-Sirius構成タンパク質の精製】細胞内のCRISPR-Sirius構築タンパク質の存在量を安定させるため、厳密に管理された濃度の市販精製dCasを卵母細胞に打ち込んだ。結果、各染色体の標識効率が大きく改善された。次に、Hisタグカラムを用いて、複合タンパク質（sgRNA結合タンパク質と蛍光タンパク質）を大腸菌から精製し、卵母細胞へと導入した。結果、減数分裂の途中で染色体の一部が断片化してしまうことが判明した。精製の際に除去しきれなかった大腸菌由来の成分が、卵母細胞内の染色体のIntegrityに影響を与えていると考えられる。今後、精製タグを変更して再挑戦する。
【染色体分配に影響を与えないイメージング条件の最適化】本研究では、3色の蛍光を同時に検出し、解析を行う。しかし、撮影条件は2色イメージングに最適化されている。3色イメージングを行う場合、励起光による卵母細胞へのダメージが懸念されたため、顕微鏡撮影の条件を最適化した。まず、全てのタイムポイント（3分おき）で、3色の蛍光タンパク質を励起・検出した結果、4割の卵母細胞が減数分裂を途中で停止してしまった（cond.1）。そこで、動態追跡に用いる1色（青）のみを3分おきに、染色体同定に用いる2色（赤と近赤）を30分おきに検出するように撮影条件を変更した。さらに、励起光を可能な限り減弱して撮影を行ったところ、イメージングによる減数分裂の停止を防ぐことができた（cond.2）。この条件において、8%の卵母細胞は減数分裂を途中で停止したが、イメージングを行わずにdish上で培養した場合においても1－2割程度の卵母細胞は減数分裂を途中で停止することが知られているため、イメージングによる影響ではないと考えられる。以上により、cond.2が3色イメージングに最適な実験条件であることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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