| 研究課題/領域番号 |
18J10121
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
水圏生産科学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
村上 悠 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2020-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2019年度)
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| 配分額 *注記 |
1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2019年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2018年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
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| キーワード | ビテロジェニン / ゲノム編集 / メダカ / 遺伝子改変 / ノックイン / ルシフェラーゼ / 卵内輸送 / CRISPR/Cas9 system / ソノポレーション |
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| 研究実績の概要 |
前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（Vtg）の部分配列（N末300 aa：以下Vtgシグナル）により、緑色蛍光タンパク質（GFP）および発光タンパク質ルシフェラーゼ（LUC）を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール（Cas9）を含めた融合タンパク質（Cas9: GFP）を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。
系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子（slc45a2; 黒色色素の合成に関連）を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay（HMA）解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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