ヒトリボヌクレアーゼＨ２の遺伝性変異がゲノム安定性に及ぼす影響の解析

• 研究課題/領域番号: 18J14339
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 馬場 美聡 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
• 研究期間 (年度): 2018-04-25 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2019年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2019年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2018年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: ゲノム修復 / 遺伝性変異 / リボヌクレアーゼH2 / 基質特異性 / ゲノム編集 / 組換え酵素

研究実績の概要

リボヌクレアーゼH2（RNase H2）は、RNA/DNA中のRNA鎖だけでなく、1個のリボヌクレオチド（R）が埋め込まれた二本鎖DNA中のRの5’側を切断する。ヒトRNase H2はA、B、Cサブユニットから成る三量体である。近年、RがヒトゲノムDNAに数千塩基対に1塩基の割合で存在し、RNase H2がこれの除去に関与していることが明らかになった。また、ヒトRNase H2の遺伝性変異が神経疾患エカルディーグティエール症候群（AGS）の原因であることが報告された。
AGS患者で同定された遺伝性変異を有する6種類の変異型酵素（A-G37S（AサブユニットのGly37がSerに置換された変異体）、A-N212I、A-R291H、B-A177T、B-V185G、C-R69W）の活性と安定性を解析した。A-G37Sの活性は野生型酵素（WT）の1%以下、他の変異体の活性はWTの51%から120%であった。222 nmの楕円率を指標とした変異体の融解温度は50℃から53℃で、WT（56℃）よりも低かった。これらのことから、A-G37Sは活性と安定性がともにWTよりも低く、他の変異体は安定性がWTよりも低いことが示唆された。
ヒトRNase H2のVal143の役割を解析した。Val143を他のアミノ酸残基に置換した19種類の変異体のうち、V143CとV143Mを除く17種類で精製酵素が得られた。1塩基のRを含む18塩基DNAとこれに相補的な18塩基DNAから成る二本鎖DNA切断活性は、WTを100%とすると、変異体は0.05%から130%であった。RNA/DNAハイブリッド切断活性は、WTを100％とすると、変異体は0.02%から42%であった。以上の結果から、ヒトRNase H2のVal143は触媒活性と基質特異性に必須ではないものの重要な役割を担うことが示された。

現在までの達成度 (段落)

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] NIH(米国)
• [国際共同研究] Biyani Girls College/University of Allahabad(インド)
• [国際共同研究] NIH(米国)
• [雑誌論文] Inhibition of HIV-1 reverse transcriptase activity by the extracts of Indian plants (2020)
  • 著者名/発表者名: Ishizuka, K., Tsutsumi, Y., Baba, M., Biyani, R., Meng, C.W., Biyani, M., Takagi, M., Jaiswal, J., Sharma, B., Kojima, K., Takita, T., and Yasukawa, K.
  • 雑誌名: Journal of Biologcal Macromolecules 巻: 20 ページ: 17-22
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Val143 of human ribonuclease H2 is not critical for, but plays a role in determining catalytic activity and substrate specificity (2020)
  • 著者名/発表者名: Baba Misato、Kojima Kenji、Nishimura Takuto、Sugiura Takuya、Takita Teisuke、Uehara Ryo、Crouch Robert J.、Yasukawa Kiyoshi
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 号: 2 ページ: e0228774-e0228774
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0228774
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Characterization of six recombinant human RNase H2 bearing Aicardi-Goutieres syndrome causing mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, T., Baba, M., Ogawa, S., Kojima, K., Takita, T., Crouch, R. J., and Yasukawa, K.
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 166 号: 6 ページ: 537-545
  • DOI: 10.1093/jb/mvz073
  • NAID: 40022093086
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Construction and characterization of ribonuclease H2 knockout NIH3T3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsukiashi, M., Baba, M., Kojima, K., Himeda, K., Teisuke T., and Yasukawa, K.
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 165 号: 3 ページ: 249-256
  • DOI: 10.1093/jb/mvy101
  • 査読あり
• [雑誌論文] Accurate fidelity analysis of the reverse transcriptase by a modified next-generation sequencing (2018)
  • 著者名/発表者名: 165.Okano, H., Baba, M., Hidese, R., Iida, K., Li, T., Kojima, K., Takita, T., Yanagihara, I., Fujiwara, S., and Yasukawa, K.
  • 雑誌名: Enzyme Microbial Technology 巻: 115 ページ: 81-85
  • DOI: 10.1016/j.enzmictec.2018.05.001
  • 査読あり
• [学会発表] ジスルフィド結合導入によるMMLV 逆転写酵素の耐熱化 (2020)
  • 著者名/発表者名: 神田橋眞子、李瞳陽、生川雄太郎、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、肥山貴圭、山崎友実、保川清
  • 学会等名: 2020年度日本農芸化学会大会
• [学会発表] リボヌクレアーゼH2を欠損させたマウス線維芽細胞株NIH3T3の性状解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 姫田康平、月足元希、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 2019年度日本生化学会近畿日本支部例会
• [学会発表] エカルディーグティエール症候群を引き起こす変異を有する6種類の組換えヒトリボヌクレアーゼH2の性状解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西村拓人、馬場美聡、小川紗央里、兒島憲二、滝田禎亮、Robert J. Crouch、保川清
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] エカルディーグティエール症候群（AGS）の患者で同定された変異を有する6種類の組換えヒトRNase H2の性状解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 小川紗央里、西村拓人、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、Robert J. Crouch、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西・中部支部合同大会（関西支部第510回講演会）
• [学会発表] ジスルフィド結合導入によるMMLV 逆転写酵素の耐熱化 (2019)
  • 著者名/発表者名: 生川雄太郎、李瞳陽、神田橋眞子、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、肥山貴圭、山崎友実、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西・中部支部合同大会（関西支部第510回講演会）
• [学会発表] Inhibition of the DNA polymerase activities of HIV-1 reverse transcriptase and HIV-1 replication by Brasenia schreberi (junsai) (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuto Tsutsumi, Keiko Ishizuka, Misato Baba, Kosaku Nishimura, Keishi Hata, Saori Takahashi, Shozo Sakuda, Teisuke Takita, Kenji Kojima, Kiyoshi Yasukawa,
  • 学会等名: BICON-2019
  • 国際学会
• [学会発表] Characterization of recombinant human ribonuclease H2 bearing Aicardi-Goutieres syndrome causing mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Takuto Nishimura, Misato Baba, Saori Ogawa, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Robert J. Crouch, Kiyoshi Yasukawa
  • 学会等名: MECC 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Construction and characterization of ribonuclease H2 knockout mouse NIH3T3 cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohei Himeda, Motoki Tsukiashi, Misato Baba, Saori Ogawa, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Kiyoshi Yasukawa
  • 学会等名: MECC 2019
  • 国際学会
• [学会発表] リボヌクレアーゼH2を欠損させたマウス線維芽由来NIH3T3細胞の樹立 (2019)
  • 著者名/発表者名: 月足元希、馬場美聡、兒島憲二、姫田康平、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年大会
• [学会発表] リボヌクレアーゼH2を欠損させたマウス線維芽由来NIH3T3細胞の性状解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 月足元希、馬場美聡、兒島憲二、姫田康平、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年大会
• [学会発表] 改良された次世代シーケンスによる逆転写酵素の正確性の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 岡野啓志、馬場美聡、秀瀬涼太、飯田慶、李瞳陽、兒島憲二、滝田禎亮、柳原格、藤原伸介、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年大会
• [学会発表] リボヌクレアーゼH2をノックアウトしたNIH3T3細胞株の性状解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 月足元希、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 2018年度日本生化学会大会
• [学会発表] リボヌクレアーゼH2を欠損したNIH3T3細胞株の樹立とその性状解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 月足元希、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部第503回講演会
• [学会発表] 部位特異的変異導入によるヒトリボヌクレアーゼ H2の基質特異性の改変 (2018)
  • 著者名/発表者名: 兒島憲二、馬場美聡、西村拓人、滝田禎亮、上原了、Robert J. Crouch、保川清
  • 学会等名: 2018年度日本生化学会近畿日本支部例会
• [学会発表] エカルディーグティエール症候群（AGS）の患者で同定された変異が導入された変異を有する組換えヒトRNase H2の性状解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 西村拓人、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部第505回講演会
• [学会発表] Next-generation sequencing-based analysis of reverse transcriptase fidelity (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiyoshi Yasukawa, Hiroyuki Okano, Misato Baba, Kei Iida, Ryota Hidese, Itaru Yanagihara, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Shinsuke Fujiwara
  • 学会等名: BICON-2018
  • 国際学会
• [学会発表] Construction and characterization of ribonuclease H2 knockout NIH3T3 cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Motoki Tsukiashi, Misato Baba, Kenji Kojima, Kouhei Himeda, Teisuke Takita, Kiyoshi Yasukawa
  • 学会等名: RNaseH2018
  • 国際学会
• [学会発表] Improved GPMA (genome profiling-based mutation assay) using mammalian cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Misato Baba, Motoki Tsukiashi, Yutaro Narukawa, Parmila Kumari, Sunita Ghimire Gautam, Koji Matsuoka, Koichi Nishigaki, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Kiyoshi Yasukawa
  • 学会等名: RNaseH2018
  • 国際学会
• [学会発表] Next-generation sequencing-based analysis of reverse transcriptase fidelity (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiyoshi Yasukawa, Hiroyuki Okano, Misato Baba, Kei Iida, Ryota Hidese, Itaru Yanagihara, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Shinsuke Fujiwara
  • 学会等名: RNaseH2018
  • 国際学会
• [学会発表] Mutations of Val143 in the catalytic subunit of human RNase H2 affect its substrate preference (2018)
  • 著者名/発表者名: Kenji Kojima，Misato Baba，Takuto Nishimura，Takuya Sugiura，Teisuke Takita，Ryo Uehara，Robert J. Crouch，Kiyoshi Yasukawa
  • 学会等名: RNaseH2018
  • 国際学会
• [備考] 酵素化学研究室ホームページ
  • URL: http://www.enzchem.kais.kyoto-u.ac.jp/