プロテオミクス／ゲノミクススクリーニング法を用いたＳＡＭＤ９分子機構の解明

• 研究課題/領域番号: 18J21048
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 内分泌学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 中尾 佳奈子 東北大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2018-04-25 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 2020年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2019年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2018年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: 近接性ラベリング解析 / TurboID / 上流調節因子の同定 / 患者由来細胞を用いたゲノミクス解析 / 結合因子の同定 / 生物学的パスウェイの同定

研究実績の概要

今年度は、プロテオミクススクリーニングの新たな取り組みとして、近接性ラベリング解析により、SAMD9の相互作用分子の同定を試みた。まずSAMD9のＣ端にTurboIDを融合させたタンパク質をドキシサイクリン誘導性に安定発現するHEK293細胞を作製した。SAMD9は野生型のほか、複数家系のMIRAGE症候群患者で同定したR459Q変異を作製した。コントロールには核外搬出シグナル（NES）とTurboIDの融合タンパク質を使用した。3種の細胞株をビオチン0.5 mMを含む培地で1.5時間培養したのち、RIPAバッファーでライセートを調整した。その後、ストレプトアビジンビーズを用いてビオチン化タンパク質を捕捉し、Q-Exactive HFによる定量的プロテオミクス解析に供した。なお、実験手技に伴うばらつきを評価するため、野生型SAMD9とNESはduplicateで行った。得られた解析データから低カウント分子を除外したのち、まずduplicate間での相関を評価したところ、極めて良好な相関を示した。次に、野生型とNLSおよび野生型SAMD9と変異体SAMD9間での比較をGene Ontology解析およびネットワーク解析で行った。その結果、いくつかSAMD9の機能に関連する可能性がある分子が同定された。その一方で、SAMD9は細胞質に局在するタンパク質であるにも関わらず、野生型SAMD9の近傍分子として核内タンパク質がエンリッチされていおり、偽陽性と考えられた。原因として、ライセートの調整中に核内から出てきた核内タンパク質にTurboIDがビオチンを付加してしまっている可能性が疑われた。現在、この問題点に対処するため、細胞質画分だけを抽出することで、ライセート中での核内タンパク質との接触を避け、再実験を行う方向で準備を進めている。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Prevalence of germline GATA2 and SAMD9/9L variants in paediatric haematological disorders with monosomy 7 (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshida, M. Tanase-Nakao, K. Shima, H. Shirai, R. Yoshida, K. Osumi, T. Deguchi, T. Mori, M. Arakawa, Y. Takagi, M. Miyamura, T. Sakaguchi, K. Toyoda, H. Ishida, H. Sakata, N. Imamura, T. Kawahara, Y. Morimoto, A. Koike, T. Yagasaki, H. Ito, S. Tomizawa, D. Kiyokawa, N. Narumi, S. Kato, M.
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 191 号: 5 ページ: 835-843
  • DOI: 10.1111/bjh.17006
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A girl with MIRAGE syndrome who developed steroid-resistant nephrotic syndrome: a case report. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ishiwa S, Kamei K, Tanase-Nakao K, Shibata S, Matsunami K, Takeuchi I, Sato M, Ishikura K, Narumi S.
  • 雑誌名: BMC Nephrol. 巻: 12 号: 1 ページ: 340-340
  • DOI: 10.1186/s12882-020-02011-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MIRAGE syndrome caused by a novel missense variant (p.Ala1479Ser) in the SAMD9 gene. (2019)
  • 著者名/発表者名: Onuma S, Wada T, Araki R, Wada K, Tanase-Nakao K, Narumi S, Fukui M, Shoji Y, Etani Y, Ida S, Kawai M.
  • 雑誌名: Hum Genome Var. 巻: 7 号: 1 ページ: 4-4
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0091-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dihydrotestosterone induces minor transcriptional alterations in genital skin fibroblasts of children with and without androgen insensitivity (2019)
  • 著者名/発表者名: Tanase-Nakao Kanako、Mizuno Kentaro、Hayashi Yutaro、Kojima Yoshiyuki、Hara Mariko、Matsumoto Kenji、Matsubara Yoichi、Igarashi Maki、Miyado Mami、Fukami Maki
  • 雑誌名: Endocrine Journal 巻: 66 号: 4 ページ: 387-393
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ18-0494
  • NAID: 130007636463
  • ISSN: 0918-8959, 1348-4540
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Fetal Goitrous Hypothyroidism and Polyhydramnios in a Patient with Compound Heterozygous DUOXA2 Mutations. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanase-Nakao K, Miyata I, Terauchi A, Saito M, Wada S, Hasegawa T, Narumi S.
  • 雑誌名: Horm Res Paediatr. 巻: 90(2) 号: 2 ページ: 132-137
  • DOI: 10.1159/000491104
  • 査読あり
• [学会発表] TurboIDによるPAX8近接タンパク質の網羅的解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 中尾 佳奈子、岩橋 めぐみ、秋葉 和壽、鳴海 覚志
  • 学会等名: 第63回日本甲状腺学会学術集会
• [学会発表] SAMD9分子標的療法に向けた構造解析と治療薬スクリーニング系の開発. (2019)
  • 著者名/発表者名: 中尾佳奈子、伊原健太郎、三嶋千恵美、新野睦子、白水美香子、鳴海覚志
  • 学会等名: 第53回日本小児内分泌学会学術集会
• [学会発表] 7番染色体片親性ダイソミーを伴うMIRAGE症候群の2例：予後良好因子としての可能性． (2018)
  • 著者名/発表者名: 中尾佳奈子、荒木亮佑、和田和子、川井正信、Bernhard Csillag、Denisa Ilencikova、鏡雅代、鳴海覚志
  • 学会等名: 第52回日本小児内分泌学会学術集会
• [学会発表] 7番染色体片親性ダイソミーを伴うMIRAGE症候群の2例：予後良好因子としての可能性． (2018)
  • 著者名/発表者名: 中尾佳奈子、荒木亮佑、和田和子、川井正信、Bernhard Csillag、Denisa Ilencikova、鏡雅代、鳴海覚志
  • 学会等名: 第63回人類遺伝学会