| 研究課題/領域番号 |
18K08554
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分55010:外科学一般および小児外科学関連
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| 研究機関 | 大阪医科薬科大学 |
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研究代表者 |
富山 英紀 大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (20298433)
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| 研究分担者 |
谷口 高平 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (70779686)
内山 和久 大阪医科薬科大学, 医学部, 名誉教授 (80232867)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2020年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2019年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2018年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | ゼブラフィッシュ / 腸管神経系 / 蠕動 / セロトニン / セロトニン神経 / 蠕動不全 |
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| 研究実績の概要 |
透明のまま発生・分化し、消化管運動の観察が可能なゼブラフィッシュを用いて、腸管神経系におけるセロトニン神経の機能と腸管蠕動不全症の病態の解明を行っている。 GAL4エンハンサートラップ法により作成されたゼブラフィッシュモデルgSAIGFF249Aを用いた免疫組織化学染色により、心臓のペースメーカーチャネルに発現しているHCN4遺伝子が、腸管神経系においてセロトニン神経で特異的に発現していることを確認した。またトリプルトランスジェニックモデル gSAIGFF249A;UAS:GFP;HuC:mCherryから、腸管神経系の発生段階におけるセロトニン神経の分化を確認し、セロトニン神経は発生初期に有意に増加することを確認した。また、機能解析に関しては、SONY SI8000セルモーションシステムによる蠕動解析システムを構築した。生きた個体での解析が可能な本システムに、収縮ベクトル別に解析することで、蠕動評価を行う新たなパラメーターを算出した。それによると、発生初期にみられる順蠕動および逆蠕動は、それぞれ異なる収縮ベクトルで形成されていることがわかり、輪走筋および縦走筋の特徴を反映していた。選択的HCNチャネル阻害剤によるセロトニン神経活動を抑制した実験と、光遺伝学を用いたトランスジェニックモデルgSAIGFF249A;UAS:ChRWR-YFPによるセロトニン神経を選択的に興奮させた実験を、SONY SI8000を用いて蠕動解析し、セロトニン神経の役割を調べた。その結果、セロトニン神経による逆蠕動制御メカニズムを解明した。そして、逆蠕動の中でも特に輪走筋の動きを選択的に制御していることがわかった。以上はサブプロジェクトとして論文をまとめており、当研究ではHCN4遺伝子のノックアウトモデルでの蠕動運動を解析することによってゼブラフィッシュ成魚におけるセロトニン神経の機能解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CRISPR/Cas9法によりHCN4遺伝子のノックアウトモデルの作成を試みていたが、何らかの理由でguide RNAをinjectionしたキメラの子孫が成魚にまで育たず、ライン化に失敗した。このため研究に遅延が生じたが、購入したHCN4遺伝子のノックアウトモデルを育成した。HCN4遺伝子には重複遺伝子(HCN4L遺伝子)が存在するが、現在はHCN4、HCN4Lそれぞれのノックアウトモデルの育成に成功しており、それらを交配させてダブルノックアウトモデルが得られた。今後はこの遺伝子変異を持つゼブラフィッシュをセロトニン神経と腸管神経の発生および保護の関与を検討する実験動物として使用する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
発生初期にアンチセンスモルフォリノを使用して一時的にHCN4遺伝子を阻害すると、腸管神経系の発達が阻害され蠕動運動が抑制されることが確認できた。今後はHCN4遺伝子のノックアウトモデルを使用し、HCN4遺伝子そのものが欠落すると腸管蠕動にどのような影響を与えるかを解析する。 また、選択的セロトニン再取り込み阻害薬であるSSRIによっても同様に腸管神経系の発達が阻害された。欧米のコホート研究で行われた妊婦のSSRI内服が、児のヒルシュプルング病の発生に影響するとの報告があり、今後ゼブラフィッシュが胎生期に難治性蠕動不全を誘発する薬剤スクリーニングモデルになり得るか検討していく。
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