研究課題/領域番号 |
18K09735
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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研究機関 | 大阪医科薬科大学 |
研究代表者 |
平田 あずみ 大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (40263587)
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研究分担者 |
高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40346185)
田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)
野村 良太 広島大学, 医系科学研究科, 教授 (90437385)
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研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2021年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2020年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2019年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2018年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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キーワード | コラーゲン結合タンパク質 / Streptococcus mutans / 機能解析 / 構造解析 / 組織内局在 / S. mutans / 結晶構造 / 病原性メカニズム / 構造機能解析 |
研究実績の概要 |
Streptococcus mutansが産生するコラーゲン結合タンパク質Cnm/Cbmは約120kDaのタンパク質で、コラーゲン結合ドメイン(CBD)を介してコラーゲンに結合する。この結合メカニズムを解明するために、CBDを構成する4つのドメイン、N1、Linker、N2、Latchに着目し解析を進めてきた。これまでに4つのドメインを組み替えた変異体を作製し、CDによる熱安定性測定とELISAによるコラーゲン結合活性測定を行うことにより、これら4つのドメインの役割をそれぞれ、N1:コラーゲンとの結合に寄与する、Linker:N1、N2を補助しコラーゲン結合を支持する、N2:構造安定性、コラーゲンとの結合において中心的役割を担う、Latch:N2を補助し、N2と相互作用することでコラーゲン結合を支持する、と予想している。本年は、Cbm_CBDの4つのドメインの予想される機能と構造の相関を結晶構造学的に裏付けることを目的に、前年に引き続き、これまでに作製したCbm_CBDの各領域変異体の結晶化を継続実施した。一方、本研究では大腸菌を用いてCbm_CBDのWTおよび19変異体の計20種の目的タンパク質を発現しているが、その過程において、Cbm_CBDの可溶性発現量は100㎎/培地1Lにもなり、精製後の最終収量が非常に多いという点、および、コラーゲンとの結合についてはKD: 3.17 micro-M を示すことを明らかにしてきた。そこで、これらの特徴を利用したコラーゲンカラムとしての活用法を検討した。カラム担体へのコラーゲンとの結合が最適な条件を設定したのち、昨年度作製したGFP_Cbmを用い、コラーゲンカラムとしての有用性を検討した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
①WTおよび19変異体タンパク質の結晶獲得には至っていない。 ②Cbm_CBDとコラーゲンの結合を活用したコラーゲンカラムの作製を試みた。担体として数種類のビーズを用いたカラムを準備し、コラーゲン、GFP_Cbmを反応させ、GFPの精製カラムとしての有用性を検討した。
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今後の研究の推進方策 |
①結晶化条件の見直しを行い、Cbm_N2-N2~の結晶化を継続する。 ②GFP_Cbmを用いてマウス各種組織におけるCbmの局在を明らかにする。 ③学会発表および論文による成果発表
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