| 研究課題/領域番号 |
18K14652
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
細田 將太郎 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80704626)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2019-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2018年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2019年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2018年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
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| キーワード | CRISPR/Cas9ゲノム編集技術 / オートファジー / プロテアーゼ / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いた哺乳類のオートファジー制御プロテアーゼの網羅的探索を行った。探索を行うにあたり、Cas9とtfLC3 (tandem fluorescence tagged LC3) を発現するHeLa細胞を作成し、フローサイトメーターによるオートファジー不全細胞の単離に必要な実験系を組み立てた。既知のオートファジー必須遺伝子の欠損細胞が取得されることを基準に、オートファジー誘導方法などの条件検討によって、オートファジー不全細胞の単離方法を確立した。またこの手法では、各階層のオートファジー制御遺伝子が単離できることも確認した。
実際のスクリーニングには、Cas9・tfLC3 発現HeLa細胞にプロテアーゼsgRNAライブラリー (473遺伝子・5030コンストラクト) をレンチウイルス（プール）によって感染させ、ノックアウト細胞を作製後、樹立した単離方法によりオートファジー不全細胞を回収した。回収した細胞群のゲノムDNAを次世代シークエンサーを用いて解析し、ゲノムに組み込まれたsgRNA配列をライブラリーのリストにマッピングすることで遺伝子の同定に成功した。
同定された遺伝子の中には、既知のオートファジー制御システインプロテアーゼATG4Bが含まれ、さらに機能未知のプロテアーゼが複数存在した。これらの遺伝子の検証結果、新規オートファジー制御因子としてセリンプロテアーゼが明らかとなった。
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