| 研究課題/領域番号 |
18KK0415
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| 研究種目 |
国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分90120:生体材料学関連
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
小林 純 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (20385404)
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| 研究期間 (年度) |
2019 – 2023
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
15,600千円 (直接経費: 12,000千円、間接経費: 3,600千円)
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| キーワード | 細胞シート / mRNA送達 / 細胞外マトリックス / リバーストランスフェクション |
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| 研究開始時の研究の概要 |
高度な代謝機能を持つ肝臓や心筋組織を細胞から作るためには、血管等の脈管構造をはじめとする細胞組織の3D微細構造の制御が必須である。基課題では、mRNA送達により3D組織内部に血管新生因子を発現させ、生体に移植可能な脈管構造をもつ3D肝臓および心筋組織の作製に取り組んでいる。しかし、非分裂性の初代肝細胞からなる肝細胞シート組織へのmRNA送達は、分裂性の細胞シート組織に比べて遺伝子導入効率が低い。そこで本国際共同研究は、細胞シート底面の細胞外マトリックスからmRNA送達を行うためのあらたな培養基材を設計し、積層化細胞シート組織内部での血管形成誘導手法開発を促進する。
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| 研究実績の概要 |
当該年度は、再現性のよい移植可能な肝細胞シート組織の構築と移植方法を確立した。具体的には、酸素供給不足を回避するために、培地深さを減少させて気相/培地界面から培養肝細胞への酸素供給を促進させた。PIPAAm修飾ポリスチレン製培養皿上で72時間培養したところ、培地深さ2.6 mmの場合、完全な単層は形成されず、死細胞の凝集といくつの欠損が見られたが、培地深さ1.3 mmでは肝細胞は単層を形成しほぼ均一なE-カドヘリンの発現が見られた。さらに、20℃で30分間培養、その後セルスクレーパーを用いてシート周縁部をこすると、肝細胞シートとして脱着した。また、ラット皮下に移植した近赤外蛍光シアニン色素染色肝細胞シート組織を蛍光in vivoイメージングシステムで認識し、移植肝細胞シート組織の生着を定量的に評価できた。
さらに、大腸菌による組み換えタンパク質ヘパリン結合性フィブロネクチン(FN)フラグメントの産生を行った。ヘパリン結合性FNフラグメントの発現は、37℃では不溶性の凝集体となったが、室温で溶解性のタンパク質として得られた。大腸菌の溶解物をHeparin Sepharose樹脂充填カラムに導入したのち、0.4 mol/L NaCl水溶液を流してタンパク質が得られた。また、ウェスタンブロッティングにより、この溶出タンパク質はFN領域を含むことが確認された。以上のことから、0.4 mol/L NaCl水溶液で溶出したタンパク質はヘパリンとの間で強い静電的相互作用で吸着しており、溶出したタンパク質はヘパリン結合性FNフラグメントであると考えられる。今後、ヘパリン結合表面上で、ヘパリン結合性FNフラグメントとmRNA/カチオンコンプレックスを固定し、遺伝子デリバリーによる血管新生因子分泌を誘導することにより、移植した肝細胞シート組織を効率的に生着されることが期待される。
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