| 研究課題/領域番号 |
19021017
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
理工系
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
荻野 千秋 神戸大学, 工学研究科, 准教授 (00313693)
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| 研究分担者 |
清水 宣明 金沢大学, 自然計測応用研究センター, 教授 (50019634)
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| 研究期間 (年度) |
2007 – 2008
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| 研究課題ステータス |
完了 (2008年度)
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| 配分額 *注記 |
5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
2008年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
2007年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | DNAアプタマー / アミノ酸 / 原子間力顕微鏡 / 80H-dG |
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| 研究概要 |
【緒言】従来、DNAアプタマーを得るためには、試験管内で、ランダム配列を持つDNA群から親和性クロマトグラフィーの原理を用いて選抜するSELEX法という手法が用いられている。しかし、この手法では、標的分子と、得られたアプタマーの結合力、及び結合特異性を操作することは難しい。そこで我々は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いた、DNAアプタマーの新規SELEX法を提案した。
【実験方法】60塩基のランダム配列を持つDNA群を、ビオチン化プライマーを用いたPCRによりビオチン化した。金板にアビジンを固定化した後、ビオチン-アビジン結合を介して一本鎖DNA群を固定化した。本研究で標的分子としているアミノ酸のL-ロイシンをカンチレバーに固定化する。L-メチオニンを含むBinding buffer中で一本鎖DNAを固定化した金板上を走査する。このとき、一本鎖DNAとL-ロイシンとの間で結合が起こり、さらにこの結合力がビオチン-アビジン結合の結合力を上回れば、ビオチン-アビジン結合が切断され、カンチレバー上に一本鎖DNAが残る。この一本鎖DNAを溶出し、PCRにより増幅する。これらの操作を1回の選抜ラウンドとし、これを繰り返すことにより、L-ロイシンに高い特異性と結合力を有するアプタマーを選抜した。
【結果と考察】セレクションのラウンド3まで行った結果、ラウンドを進めるのに従って、それぞれラウンドのL-ロイシンと一本鎖DNA間の平均結合力が増加していった。このことから、L-ロイシンに対してのアプタマーが選抜されていると考えられる。また、得られたアプタマーの配列および、二次構造を解析したところ、構造中にアプタマー内の構造として代表的なループ構造を有していることが確認された。
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