Yipタンパク質ファミリーの結晶構造解析

• 研究課題/領域番号: 19036005
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 深井 周也 東京大学, 放射光連携研究機構, 准教授 (10361792)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2008
• 研究課題ステータス: 完了 (2008年度)
• 配分額: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円); 2008年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2007年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
• キーワード: X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 低分子量GTPase / 小胞輸送 / 膜融合 / 分子間相互作用

研究概要

Yipファミリーは、RabからGDP解離阻害因子を解離させて脂質修飾部位を露出させ、Rabを膜に固定させる働きを担う。本研究ではYipファミリーによるRabの脂質膜への固定メカニズムを原子分解能レベルで解明することを目的としてYipタンパク質の結晶構造を決定することを目指した。出芽酵母由来の6種類のYipタンパク質のうち、イントロンを含むYip3p以外について遺伝子をクローニングした。Yip2pは報告されている配列と5'端の配列が異なっており、ORFが明確でなかったため発現の候補から除外し、最終的にYiplp, Yip4p, Yip5p, Yiflp遺伝子をPiohia pastorisの発現ベクターであるpPICZおよびpPIczαに組み込んだ。DTTとLi_2SO_4で細胞を処理することにより形質転換効率を上げ、Yiplpについて、2g/LのZeocin存在下で生育することが可能な形質転換体を得た。17の形質転換体に対してメタノール添加による発現誘導を行い、膜画分を調製してC末端に付加したHis_6タグに対する抗体をもちいたウエスタンブロッティングによる発現の確認を行ったが、発現を確認することはできなかった。そこで、GFP融合タンパク質をつかった発現を試みたところ、N末端にGFPを付加したコンストラクトで膜画分への発現をGFPの蛍光により確認することができた。一方、膜タンパク質の結晶構造解析法の開発という観点から、原核生物由来の膜透過装置の結晶構造決定を行なった。SecYE(G)複合体は膜透過のためのチャネルであり、ATPaseであるSecAが膜透過装置を駆動させてタンパク質を細胞質からペリプラズムへと輸送する。高度好熱菌由来のSecYEとその特異的抗体のFab断片との複合体の結晶構造を3.2A分解能で決定した。

研究成果

• [雑誌論文] Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures (2008)
  • 著者名/発表者名: Tsukazaki, T., Mori, H., Fukai, S., Ishitani, R., Mori, T., Dohmae, N., Perederina, A., Sugita, Y., Vassylyev, D.G. , Ito, K., Nureki, O.
  • 雑誌名: Nature 455 ページ: 988-991
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for specific cleavage of Lys 63-linked polyubiquitin chains (2008)
  • 著者名/発表者名: Sato, Y., Yoshikawa, A., Yamagata, A., Mimura, H., Yamashita, M., Ookata, K., Nureki, O., Iwai, K., Komada, M., Fukai, S.
  • 雑誌名: Nature 455 ページ: 358-362
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal Structure of the MgtE Mg^<2+> transporter (2007)
  • 著者名/発表者名: M. Hattori, Y. Tanaka, S. Fukai, R. Ishitani, O. Nureki
  • 雑誌名: Nature 448 ページ: 1072-1075
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the full-length Mg^<2+> transporter (2007)
  • 著者名/発表者名: M. Hattori, Y. Tanaka, S. Fukai, R. Ishitani, O. Nureki
  • 雑誌名: Acta Crystallographica F 63 ページ: 682-684
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the cytosolic domain of the Mg^<2+> transporter MgtE (2007)
  • 著者名/発表者名: M. Hattori, Y. Tanaka, S. Fukai, R. Ishitani, O. Nureki
  • 雑誌名: Acta Crystallographica F 63 ページ: 678-681
  • 査読あり
• [学会発表] AMSHファミリーによるK63結合型ポリユビキチン鎖特異的な切断活性機構の構造的基盤 (2008)
  • 著者名/発表者名: 佐藤裕介(深井周也)
  • 学会等名: BMB2008
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2008-12-12
• [学会発表] Structural basis of selective cleavage of Lys63-linked polyubiquitin chains by JAMM ubiquitin isopeptidase (2008)
  • 著者名/発表者名: 深井周也
  • 学会等名: FASEB Summer Research Conferences Ubiquitin and Cellular Reaulation
  • 発表場所: Saxton' s River, Vermont, USA
  • 年月日: 2008-06-16
• [学会発表] Crystal Structure of the MgtE Mg^<2+> transporter (2007)
  • 著者名/発表者名: 服部素之(発表者)、田中良樹、深井周也、石谷隆一郎、濡木理
  • 学会等名: 第八回アジア結晶学会年会(AsCA'07)
  • 発表場所: Howard International House Taipei
• [学会発表] マグネシウム輸送体MgtEのX線結晶構造解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 服部素之(発表者)、田中良樹、深井周也、石谷隆一郎、濡木理
  • 学会等名: 第45回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
• [図書] 実験医学2月号 (2009)
  • 著者名/発表者名: 深井周也、佐藤裕介、吉川梓
  • 出版者: 羊土社