| 研究概要 |
本年度は, CLASPのEB1やチューブリンや微小管結合ドメインの試料調製を進めるとともに相互作用を解析した. 先ず, in vivoの機能解析が進んでいるCLASP2γを用いて, EB1との結合に関与するドメインの種々の発現コンストラクトを作成して, 大腸菌をホストとした高効率の調製系を確立した. 発現タンパク質のGSTタグを利用して, 簡便なpull-downアッセイでEB1と結合する領域を同定した. 更に, この最小の結合領域を用いて, EB1-CLASP2γ複合体を結晶化ロボット(既設のHYDRA-II)を用いて結晶化スクリーニングした. その結果, 複合体結晶を得られたので, セレノメチオニン誘導試料結晶も調製して, SPring-8での放射光実験によりx線強度データを収集した. MAD法とMRを組み合わせて位相決定して, 複合体構造を精密化した. その結果, EB1のα-らせんの束が形成する疎水性ポケットにCLASP2γのIPモチーフが結合していることが明らかとなった.さらに, IPモチーフの周辺の相互作用に重要な残基も同定した. 今後, 得られた構造に基づいた点変異実験を組み合わせた機能解析により, 特異性に重要な残基を決定するとともに, チューブリンや微小管、他の+TIPとCLASPとの間の相互作用の関係, 正または負に干渉する, あるいは全く干渉しない, を解析して機能との関係を考察した後に, 論文としてまとめる.
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