| 研究概要 |
注目している生体分子同士や他の生体分子間の相互作用の強さを生きている細胞内で可視化することは、動的な生体機能を可視化することに直結すると考えた。そこで細胞核内の構造を蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)を利用して, 分子運動の特性に注目して解析し, これまでのイメージング手法では明らかにできなかった核の機能と密接関連したダイナミックな機構が存在する事を目指した。しかし, 拡散測定に基礎をおくFCSだけでは分子量比が極端に大きくないと分子間の相互作用が検出できない、また内在性タンパク質の影響が無視できないなどの限界があり, それを乗り越えるために一分子蛍光強度と新たに空間相互相関測定を利用してこれまでの研究をさらに発展させていくことを計画した。そのためにまず走査型2点測定FCS装置の試作と細胞内相互作用測定法を確立した。
次に具体的なターゲットとしてGlucocorticoid Receptor(GR)に注目した。我々のこれまでのFCS測定の結果、核内でGRが二量体化することで転写調節が開始されるという機構を示唆しているが、細胞のどこで(空間)、何時(時間)2量化するかは不明のままである。その解明のため、まずFCS時間相関解析における蛍光寿命解析による2量体補正を完成させることを目指した。これまでさまざまなリンカー長を有する約20種類のGFP2量体を作成し, その長さとFCSにおける一分子蛍光強度との関係を明らかにした。リンカー長が短くなるとホモFRETがおきるために蛍光寿命が短くなり, それに伴い蛍光強度も小さくなり, FCSにおける一分子あたりの蛍光強度も低下した。しかし, ある長さ以下の組み合わせでは蛍光強度が回復するところがあり, そのリンカー配列以降で構造変化が示唆され, その部分までがFCSにおける2量体測定の定量的な測定が可能であることが分かった。今後, FCSの一分子蛍光強度を指標にして細胞質ならびに核内におけるGR2量体形成量の詳細な解析を目指す予定である。
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