生細胞における非天然型アミノ酸のタンパク質への導入技術の開発

• 研究課題/領域番号: 19380195
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用分子細胞生物学
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 坂本 健作 独立行政法人理化学研究所, 拡張遺伝暗号システム研究チーム, チームリーダー (50240685)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2009
• 研究課題ステータス: 完了 (2009年度)
• 配分額: 19,240千円 (直接経費: 14,800千円、間接経費: 4,440千円); 2009年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円); 2008年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2007年度: 11,570千円 (直接経費: 8,900千円、間接経費: 2,670千円)
• キーワード: 非天然型アミノ酸 / 遺伝暗号 / タンパク質生合成 / 光クロスリンク / 翻訳後修飾 / 蛍光修飾 / 昆虫細胞 / 蛍光標識 / アセチルリジン / ピロリジルtRNA合成酵素 / 動物細胞 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 膜タンパク質

研究概要

生物で遺伝的にコードされている20種類のアミノ酸以外の「非天然型アミノ酸」を生細胞内でタンパク質に部位特異的に導入する技術の開発を進め、タンパク質研究への応用を行った。この結果、(1)哺乳類細胞内でタンパク質を部位特異的に蛍光標識すること、(2)天然型の翻訳後修飾の人為的に導入すること、(3)光クロスリンク法によって新規なタンパク質間相互作用を発見すること、(4)昆虫細胞における非天然型アミノ酸の導入、が可能になった。

研究成果

• [雑誌論文] Functional replacement of the endogenous tyrosyl-tRNA synthetase-tRNATyr pair by the archaeal tyrosine pair in Escherichia coli for genetic code expansion (2010)
  • 著者名/発表者名: Iraha, F., Oki, K., Kobayashi, T., Ohno. S., Yokogawa, T., Nishikawa, K., Yokoyama, S., Sakamoto, K.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic encoding of non-natural amino acids in Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Mukai, T., Wakiyama, M., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Protein Sci 19 ページ: 440-448
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional replacement of the endogenous tyrosyl-tRNA synthetase-tRNA^<Tyr> pair by the archaeal tyrosine pair in Escherichia coil for genetic code expansion (2010)
  • 著者名/発表者名: Iraha, F., Oki, K., Kobayashi, T., Ohno, S., Yokogawa, T., Nishikawa, K., Yokoyama, S., Sakamoto, K.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic encoding of non-natural amino acids in Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Mukai, T., Wakiyama, M., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Protein Science (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic encoding of 3-iodo-L-tyrosine in Escherichia coli for single-wavelength anomalous dispersion phasing in protein crystallography (2009)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto, K., Murayama, K., Oki, K., Iraha, F., Kato-Murayama, M., Takahashi, M., Ohtake, K., Kobayashi, T., Kuramitsu, S., Shirouzu, M., Yokoyama S.
  • 雑誌名: Structure 17 ページ: 335-344
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recognition of non-α-amino substrates by pyrrolysyl-tRNA synthetase (2009)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, T., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: J. Mol. Biol 385 ページ: 1352-1360
  • 査読あり
• [雑誌論文] ヨードチロシンの部位特異的導入と長波長X線を用いた単波長異常分散法による結晶構造解析 (2009)
  • 著者名/発表者名: 村山和隆、坂本健作
  • 雑誌名: 日本結晶学会誌 Vo.51 ページ: 251-257
  • NAID: 10025158410
• [雑誌論文] Genetic encoding of 3-iodo-L-tyrosine in Escherichia coli for single-wavelength anomalous dispersion phasing in protein crystallography (2009)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto, K., Murayama, K., Oki, K., Iraha, F., Kato-Murayama, M., Takahashi, M., Ohtake, K., Kobayashi, T., Kuramitsu, S., Shirouzu, M., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Structure 17 ページ: 335-344
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recognition of non-α-amino substrates by pyrrolysyl-tRNA synthetase (2009)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, T., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 385 ページ: 1352-1360
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multi-step engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N-(o-azidobenzyl oxycarbonyl)lysine for site-specific protein modification (2008)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Chem. Biol 15 ページ: 1187-1197
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transplantation of a tyrosine editing domain into a tyrosyl-tRNA synthetase variant enhances its specificity for a tyrosine analog (2008)
  • 著者名/発表者名: Oki, K., Sakamoto, K., Kobayashi, T., Sasaki, H.M., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Proc. Natl Acad. Sci. USA 105 ページ: 13298-13303
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adding L-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases (2008)
  • 著者名/発表者名: Mukai, T., Kobayashi, T., Hino, N., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun 371 ページ: 818-822
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallographic studies on multiple conformational states of active-site loops in pyrrolysyl-tRNA synthetase (2008)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: J. Mol. Biol 378 ページ: 634-52
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multi-step engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode Nε-(o-azidobenzyloxycarbonyl)lysine for site-specific protein modification (2008)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Chemistry & Biology 15 ページ: 1187-1197
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transplantation of a tyrosine editing domain into a tyrosyl-tRNA synthetase variant enhances its specificity for a tyrosine analog (2008)
  • 著者名/発表者名: Oki, K., Sakamoto, K., Kobayashi, T., Sasaki, H. M., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 105 ページ: 13298-13303
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adding L-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases (2008)
  • 著者名/発表者名: Mukai, T., Kobayashi, T., Hino, N., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 371 ページ: 818-822
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallographic studies on multiple conformational states of active-site loops in pyrrolysyl-tRNA synthetase (2008)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 378 ページ: 634-52
  • 査読あり
• [雑誌論文] Site-specific incorporation of non-natural amino acids into proteins in the mammalian cells with an expanded genetic code (2007)
  • 著者名/発表者名: Hino, N., Hayashi, A., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Nature protocol 1 ページ: 2957-2962
  • 査読あり
• [雑誌論文] 非天然型アミノ酸をタンパク質へ部位特異的に導入する技術の開発とその応用 (2007)
  • 著者名/発表者名: 坂本健作、横山茂之
  • 雑誌名: 蛋白核酸酵素(共立出版) Vol.54,No.12 ページ: 65-71
• [雑誌論文] 分子計算のための一点から開始される探索法 (2007)
  • 著者名/発表者名: 染谷 博司, 山村 雅幸, 坂本 健作
  • 雑誌名: 人工知能学会論文誌 22 ページ: 405-415
  • NAID: 10022007810
  • 査読あり
• [学会発表] 遺伝暗号拡張のための大腸菌内在性チロシン翻訳系の置換 (2009)
  • 著者名/発表者名: 伊良波史枝、大野敏、横川隆志、西川一八、横山茂之、坂本健作
  • 学会等名: 第32回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2009-12-12
• [学会発表] 翻訳後修飾アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入 (2009)
  • 著者名/発表者名: 小林隆嗣、坂本健作、柳沢達男、横山茂之
  • 学会等名: 第4回無細胞生命科学研究会
  • 発表場所: 岐阜
• [学会発表] タンパク質複合体の光架橋による結晶構造解析技術の開発 (2009)
  • 著者名/発表者名: 佐藤心、三桝信哉、佐藤文、樋野展正、坂本健作、梅原崇史、横山茂之
  • 学会等名: 第32回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] タンパク質の特定のモチーフを介するタンパク質間相互作用の細胞内光クロスリンク法による網羅的解析 (2008)
  • 著者名/発表者名: 樋野展正, 尾山大明, 佐藤文, 向井崇人, 秦裕子, 山本雅, 坂本健作, 横山茂之
  • 学会等名: 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会(BMB2008)
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2008-12-12
• [学会発表] 光クロスリンク法を用いた特定のモチーフを介するタンパク質間相互作用の網羅的解析 (2008)
  • 著者名/発表者名: 樋野展正、尾山大明、佐藤文、向井崇人、秦裕子、山本雅、坂本健作、横山茂之
  • 学会等名: 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会合同大会(BMB2008)
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] 動物細胞における非天然型アミノ酸導入技術の拡張 (2007)
  • 著者名/発表者名: 向井 崇人、小林 隆嗣、樋野 展正、柳沢 達男、林 明子、坂本 健作、横山 茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-11
• [学会発表] 光クロスリンカーのタンパク質への部位特異的な導入と複合体解析への応用 (2007)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 文、樋野 展正、林 明子、伊良波 史枝、向井 崇人、梅原 崇史、坂本 健作、岩崎 健一郎、横山 茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-11
• [学会発表] SILAC法を併用したin vivo光クロスリンク法によるタンパク質間相互作用の網羅的解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 樋野 展正、向井 崇人、佐藤 文、林 明子、伊良波 史枝、尾山 大明、秦 裕子、坂本 健作、横山 茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-11
• [学会発表] 「原始的な」アミノアシルtRNA合成酵素を用いた生体内における非天然型主鎖・側鎖構造のタンパク質への部位特異的導入 (2007)
  • 著者名/発表者名: 小林 隆嗣、柳沢 達男、坂本 健作、横山 茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-11
• [学会発表] 光クロスリンク能を有する新規非天然型アミノ酸Tmd-Pheを認識するアミノアシルtRNA合成酵素の探索 (2007)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 文、樋野 展正、坂本 健作、横山 茂之
  • 学会等名: 9th RNA meeting
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2007-07-28
• [学会発表] 同一の非天然型アミノ酸を認識する二つの異なった分子機構 (2007)
  • 著者名/発表者名: 大木 健二、坂本 健作、小林 隆嗣、横山 茂之
  • 学会等名: 9th RNA meeting
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2007-07-28
• [学会発表] 光クロスリンク能を持つ非天然型アミノ酸をタンパク質に導入することによる細胞内タンパク質間相互作用解析法 (2007)
  • 著者名/発表者名: 樋野 展正、向井 崇人、佐藤 文、坂本 健作、横山 茂之
  • 学会等名: 第7回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2007-05-24
• [学会発表] ヨードチロシンのタンパク質への部位特異的な導入と単波長異常分散法によるタンパク質結晶構造解析への応用 (2007)
  • 著者名/発表者名: 坂本健作、大木健二、村山和隆、小林隆嗣、白水美香子、横山茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] 非天然型アミノ酸の導入によるタンパク質の部位特異的な蛍光標識技術 (2007)
  • 著者名/発表者名: 伊良波史枝、向井崇人、佐藤文、林明子、樋野展正、保坂俊彰、山登一郎、大野敏、横川隆志、西川一八、坂本健作、横山茂之
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会(BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
• [備考]
  • URL: http://protein.gsc.riken.go.jp/sakamoto/
• [備考]
  • URL: http://protein.gsc.riken.go.jp/sakamoto/
• [産業財産権] アミノアシルtrna合成酵素活性を有するポリペプチド及びその利用 (2008)
  • 発明者名: 大木健二、坂本健作、横山茂之
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2008-029236
  • 出願年月日: 2008-02-08
• [産業財産権] アミノアシルtRNA合成酵素活性を有するポリペプチド及びその利用 (2008)
  • 発明者名: 大木 健二、坂本 健作、横山 茂之
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2008-029236
  • 出願年月日: 2008-02-08
• [産業財産権] 変異体ピロリジル-trna合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法 (2007)
  • 発明者名: 小林隆嗣, 坂本健作, 横山茂之, 柳沢達男
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2007-243574
  • 出願年月日: 2007-09-20
• [産業財産権] 変異体ピロリジル-tRNA合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法 (2007)
  • 発明者名: 小林 隆嗣、柳沢 達男、坂本 健作、横山 茂之
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2007-243574
  • 出願年月日: 2007-09-20
• [産業財産権] エステル結合を含む非天然タンパク質の製造方法 (2007)
  • 発明者名: 小林 隆嗣、柳沢 達男、向井 崇人、坂本 健作、横山 茂之
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2007-302452
  • 出願年月日: 2007-11-22
• [産業財産権] エステル結合を含む非天然タンパク質の製造方法
  • 発明者名: 小林隆嗣, 向井崇人, 坂本健作, 横山茂之, 柳沢達男
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2007-302452