培養系を用いたE型肝炎ウイルスの性状分析と増殖機構解明

• 研究課題/領域番号: 19390134
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ウイルス学
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 岡本 宏明 自治医科大学, 医学部・感染免疫学講座ウイルス学部門, 教授 (30177092)
• 研究分担者: 田中 利典 自治医科大学, 医学部・感染免疫学講座ウイルス学部門, 講師 (30146154) ; 高橋 雅春 自治医科大学, 医学部・感染免疫学講座ウイルス学部門, 講師 (70326841)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2008
• 研究課題ステータス: 完了 (2008年度)
• 配分額: 18,460千円 (直接経費: 14,200千円、間接経費: 4,260千円); 2008年度: 8,710千円 (直接経費: 6,700千円、間接経費: 2,010千円); 2007年度: 9,750千円 (直接経費: 7,500千円、間接経費: 2,250千円)
• キーワード: 分子 / E型肝炎ウイルス / 細胞培養 / 感染性cDNAクローン / モノクローナル抗体 / 蛍光抗体法 / ORF3欠損変異ウイルス / ORF3抗原 / 放出機構 / 中和抗体 / ORF2抗原 / 劇症肝炎

研究概要

本研究は、研究代表者らが世界で初めて確立することができたE 型肝炎ウイルス(HEV)の感染培養系を用いた研究である。
1) E 型肝炎患者の糞便浮遊液中に含まれるHEV 野生株(JE03-1760F_wt、遺伝子型3)をPLC/PRF/5 細胞に接種し、培養液中に放出された子孫ウイルスを新たな細胞に感染させる継代培養を13 回繰り返すことによって、野生株より10 倍以上感染効率の高い馴化HEV(JE03-1760F_p13)を得ることができた。また、E 型劇症肝炎患者から得られた糞便浮遊液を接種することにより、新たに4 型HEV(HE-JF5/15F)株の培養系を確立することができた。JE03-1760F 株と同様に、培養液中に産生された子孫HE-JF5/15F ウイルスは感染性を有し、6代目の継代培養において、接種後2 日目に培養上清中での子孫ウイルスの出現が確認され、10日目には1.5 x 10^8 copies/ml のウイルス量に達した。HE-JF5/15F_p6 ウイルスに認められたORF1 領域とORF2 領域での10 塩基(4 アミノ酸残基)の変異が活発な増殖能に関連があると考えられた。
2) カイコ蛹で発現した組換えHEV キャプシド(ORF2)抗原蛋白質を免疫原として、9 種類のマウスモノクローナル抗体を作製した。そのうちの1 つ(H6225)は、HEV 粒子との結合能を有し、強い感染阻止能(中和活性)を有することが感染培養実験によって明らかになった。また、HEVORF3 蛋白質のC 末端に相当する24-mer 合成ペプチドを用い10 種類のマウスモノクローナル抗体を作製した。これら抗ORF2, ORF3 モノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により、ORF2 抗原は細胞質、とくに小胞体とゴルジ体、ORF3 抗原は細胞質および細胞質膜に局在することがわかった。
3) 培養上清中に放出されたHEV 粒子はショ糖液中での浮上密度が1.15 g/ml と軽く、糞便中のHEV 粒子(1.26-1.27 g/ml)と異なること、そしてその表面に細胞膜成分とともにORF3 蛋白を有すること、加えてそれら細胞膜成分とORF3 蛋白は界面活性剤と蛋白分解酵素による処理によって除かれ、糞便中HEV 粒子と同様の浮上密度に変化しうることを明らかにした。
4) A549 細胞とPLC/PRF/5 細胞において、糞便由来野生株(JE03-1760F)と同等の感染性と増殖能を有する感染性cDNA クローン(pJE03-1760F/wt)を構築することができた。加えて、ORF3のATG コドンをGCA に置換した変異ウイルス(pJE03-1760F/ΔORF3)を作製し、培養細胞に接種したところ、感染性を有していることが分かった。しかし、ORF3 欠損変異ウイルスは細胞内でのHEV RNA レベルが野生株と同等でありながら、培養上清中ではHEV RNA は検出されないか、極めて低いレベルであり、分泌能を欠いていることが明らかになった。
本研究により、これまで機能が不明であったORF3 蛋白はHEV 粒子の放出に必須であり、放出された粒子上に細胞膜成分とともに構造蛋白の一つとして存在していることが初めて明らかになった。これらの研究成果は、HEV 感染の制御ならびに増殖機構や放出機構のさらなる解明に役立つものと考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] ORF3 protein of hepatitis E virus is essential for virion release from infected cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada K, Takahashi M, Hoshino Y, Takahashi H, Ichiyama K, Tanaka T, Okamoto H
  • 雑誌名: J Gen Virol doi:10.1099/Vir.0.010561-0(In press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and characterization of a genotype 4 hepatitis E virus cell culture system using the HE-JF5/15F strain recovered from a fulminant hepatitis patient. (2009)
  • 著者名/発表者名: Tanaka T, Takahashi M, Takahashi H, Ichiyama K, Hoshino Y, Nagashima S, Mizuo H, Okamoto H
  • 雑誌名: J Clin Microbiol 47 ページ: 1906-1910
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of an infectious cDNA clone of hepatitis E virus strain JE03-1760F that can propagate efficiently in cultured cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada K, Takahashi M, Hoshino Y, Takahashi H, Ichiyama K, Tanaka T, Okamoto H
  • 雑誌名: J Gen Virol 90(2) ページ: 457-462
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sporadic acute hepatitis E occurred constantly during the last decade in northeast Japan. (2009)
  • 著者名/発表者名: Inoue J, Ueno Y, Nagasaki F, Akahane T, Fukushima K, Kogure T, Kondo Y, Kakazu E, Tamai K, Kido O, Nakagome Y, Ninomiya M, Obara N, Wakui Y, Takahashi M, Okamoto H, Shimosegawa T
  • 雑誌名: J Gastroenterol 44 ページ: 329-337
  • NAID: 10025174367
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of an infectious cDNA clone of hepatitis E virus strain JE03-1760F that can propagate efficiently in cultured cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada K
  • 雑誌名: Journal of General Virology 90 ページ: 457-462
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of monoclonal antibodies against hepatitis E virus capsid protein and evaluation of their neutralizing activity in a cell culture system. (2008)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Hoshino Y, Tanaka T, Takahashi H, Nishizawa T, Okamoto H
  • 雑誌名: Arch Virol 153 ページ: 657-666
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monoclonal antibodies raised against the ORF3 protein of hepatitis E virus (HEV) can capture HEV particles in culture supernatant and serum but not those in feces. (2008)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Yamada K, Hoshino Y, Takahashi H, Ichiyama K, Tanaka T, Okamoto H
  • 雑誌名: Arch Virol 153 ページ: 1703-1713
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational events during the primary propagation and consecutive passages of hepatitis E virus strain JE03-1760F in cell culture. (2008)
  • 著者名/発表者名: Lorenzo FR, Tanaka T, Takahashi H, Ichiyama K, Hoshino Y, Yamada K, Inoue J, Takahashi M, Okamoto H
  • 雑誌名: Virus Res 137 ページ: 86-96
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monoclonal antibodies raised against the 0RF3 protein of hepatitis E virus (HEV) can capture HEV particles in culture supernatant and serum but not those in feces. (2008)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M
  • 雑誌名: Archives of Virology 153 ページ: 1703-1713
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational events during the primary propagation and consecutive passages of hepatitis E virus strain JE03-1760F in cell culture. (2008)
  • 著者名/発表者名: Lorenzo FR
  • 雑誌名: Virus Research 137 ページ: 86-96
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan. (2007)
  • 著者名/発表者名: Gotanda Y, Iwata A, Ohnuma H, Yoshikawa A, Mizoguchi H, Endo K, Takahashi M, Okamoto H
  • 雑誌名: J Med Virol 79 ページ: 734-742
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of the full-length genome of hepatitis E virus isolates obtained from farm pigs in Mongolia. (2007)
  • 著者名/発表者名: Lorenzo FR, Tsatsralt-Od B, Ganbat S, Takahashi M, Okamoto H
  • 雑誌名: J Med Virol 79 ページ: 1128-1137
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of genotype 4 hepatitis E virus strains from a patient with acute hepatitis E and farm pigs in Bali, Indonesia. (2007)
  • 著者名/発表者名: Wibawa IDN, Suryadarma IGA, Mulyanto, Tsuda F, Matsumoto Y, Ninomiya M, Takahashi M, Okamoto H
  • 雑誌名: J Med Virol 79 ページ: 1138-1146
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic variability and evolution of hepatitis E virus. (2007)
  • 著者名/発表者名: Okamoto H.
  • 雑誌名: Virus Res 127(2) ページ: 216-228
  • 査読あり
• [雑誌論文] Unchanged high prevalence of antibodies to hepatitis E virus (HEV) and HEV RNA among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan during 1991-2006. (2007)
  • 著者名/発表者名: Fukuda S, Ishikawa M, Ochiai N, Suzuki Y, Sunaga J, Shinohara N, Nozawa K, Tsuda F, Takahashi M, Okamoto H
  • 雑誌名: Arch Virol 152 ページ: 1623-1635
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prolonged fecal shedding of hepatitis E virus (HEV) during sporadic acute hepatitis E: evaluation of infectivity of HEV in fecal specimens in a cell culture system. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Tanaka T, Azuma M, Kusano E, Aikawa T, Shibayama T, Yazaki Y, Mizuo H, Inoue J, Okamoto H
  • 雑誌名: J Clin Microbiol 45(11) ページ: 3671-3679
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and evaluation of an efficient cell-culture system for Hepatitis E virus. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tanaka T, Takahashi M, Kusano E, Okamoto H.
  • 雑誌名: J Gen Virol 88 ページ: 903-911
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic variability and evolution of hepatitis E virus (2007)
  • 著者名/発表者名: Okamoto H
  • 雑誌名: Virus Research 127 ページ: 216-228
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prolonged fecal shedding of hepatitis E virus(HEV)druing sporadic acute hepatitis E:evaluation of infectivity of HEV in fecal specimens in a cell culture system. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M
  • 雑誌名: Journal of Clinical Microbiology 45 ページ: 3671-3679
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of the full-length genome of hepatitis E Virus isolates obtained from farm pigs in Mongolia (2007)
  • 著者名/発表者名: Lorenzo FR
  • 雑誌名: Journal of Medical Virology 79 ページ: 1128-1137
  • 査読あり
• [学会発表] 肝炎ウイルス研究のカッティングエッジ 基礎から臨床への贈り物 E 型肝炎ウイルス研究の進歩 (2008)
  • 著者名/発表者名: 岡本宏明
  • 学会等名: 第12 回日本肝臓学会大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2008-10-01
• [学会発表] Viral genotyping/sequencing の臨床的意義Genotype 4 のE 型肝炎ウイルスの全長塩基配列の解析による劇症化に関連する塩基の同定 (2008)
  • 著者名/発表者名: 井上淳, 上野義之, 岡本宏明
  • 学会等名: 第12 回日本肝臓学会大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2008-10-01
• [学会発表] 札幌市内3 医療機関に於ける最近10 年間の急性E 型肝炎の変遷 (2008)
  • 著者名/発表者名: 水尾仁志, 姜貞憲, 狩野吉康, 本城信吾, 松居剛志, 荒川智宏, 岡本宏明, 三代俊治
  • 学会等名: 第44 回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: 松山
  • 年月日: 2008-06-05
• [学会発表] 当院で経験した急性E 型肝炎の2 症例 (2007)
  • 著者名/発表者名: 岡野 宏,西村 晃,村田一素,岡本宏明
  • 学会等名: 第37 回日本肝臓学会西部会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2007-12-07