| 研究概要 |
作成したNOS-Cre/tet-onマウスとHA,Chop2-Cre-reporter mouseの作動確認:本研究では、すでに作成したnNOS-Cre/tet-onマウスとHA,Chop2-Cre-reporter mouseの作動が正確であるかどうかを確認した。それぞれのDNAコンストラクトは、ドキシサイクリン投与まではCreの働きを最低限に抑えられるようにcultured-cellで十分にモニター実験を繰り返したものであった。両者を掛け合わせ生まれたマウスが4週齢以上に成育して、興奮性神経細胞でのnNOS promoter活性が終息した段階に、ドキシサイクリンを常時飲水の中に添加して、bidirectional promoter上のrtTSサプレッサーを除き、rtTA2Mの結合を促してFlpeを発現させ、一週間程度の期間を掛けてnNOS陽性細胞にCreを発現させた。CreはloxPではさまれたmodified red fluorescent protein (mRFP) cDNAを除くことにより、HR,Chop2, YFPがCAG promoterの下流に来て、3つの蛋白発現が始まる事が期待された。さらに2-3日の生存期間をおいて灌流固定し、nNOSとGFPに対する二重免疫組織化学を行い、明らかなGFP陽性でnNOS陰性の細胞が無いことを期待していた。GFP陰性nNOS陽性の細胞は、tet-onからCreによるDNAの組み換えにいたらなかった場合であり、全てが二重染色になるようにドキシサイクリンの投与量と期間を調整した(全てのnNOS陽性細胞のレポーター標識)。しかし、現在までのところtet-on systemが予定通りの頻度で働いておらず、望む実験ができていない。
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