| 研究課題/領域番号 |
19657048
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
廣明 秀一 神戸大学, 医学研究科, 特命教授 (10336589)
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| 研究期間 (年度) |
2007 – 2008
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| 研究課題ステータス |
完了 (2008年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2008年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2007年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | バイオイメージング / 細胞内小胞輸送 / エンドソーム / マクロピノソーム / ランタニド結合タグ / タンパク質導入ドメイン |
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| 研究概要 |
本研究の目的は(1)わずか17アミノ酸残基の蛍光標識タグであるランタニド結合タグ(LBT)を用いた細胞生物学研究に適したバイオイメージング技術を確立すること、(2)とくにマクロピノサイトーシスやエンドソームのリサイクル現象を可視化すること、(3)新規のタンパク質細胞内導入ドメイン(PTD)を単離すること、の3点である。これらについて以下の成果を得た。
●哺乳動物細胞での遺伝子発現ベクターpCDNA3.1にクローニングされた遺伝子に、LBTタグを付加して培養細胞でのタンパク質の発現を確認した。マクロピノサイトーシス時の細胞骨格の再構成の可視化に向けて、別途GFP-tubulinの安定発現細胞株の樹立を行った。LBTで可視化した別の細胞骨格・エンドソーム関連因子との二重染色の実験は現在進行中である。
●ヒトの蛋白質由来の新規PTD配列2種(IGFBP-3/IGFBP-5)を単離同定し、その細胞内導入の経路が
HIV-TATと同様のヘパリン依存的マクロピノサイトーシス経路であることを明らかにした(Exp.Cell Res.,314 2352-2361.(2008))。
●IGFBP-5由来の新規PTD配列のヘパリン結合時の立体構造を調べた結果、HIV-TATと異なりa-helix構造が誘導されないことが明らかになった。この差がIGFBP由来PTDとHIV-TATの導入速度の差に関連して,いる可能性がある。
●京都大学との共同研究を行い、LBT-PTD-二重タグ付きUbが活用して導入効率の向上を検定した。
HIV-TAT由来PTDを用いて蛋白質導入を行い、最終的に生きたヒト細胞に15N標識した蛋白質を導入し
その多次元NMRを測定するIn-cell NMRP技術の確立に貢献した(Nature458106-109(2009)).
これらの研究は、おおむね研究実施計画どおりに進行しており、マクロピノサイトーシスの観察手法とし
てのLBT蛍光イメージング法はほぼ実用化できた。
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