脂肪細胞から核の初期化を経て誘導した軟骨細胞による軟骨修復

• 研究課題/領域番号: 19659378
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 整形外科学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 妻木 範行 大阪大学, 医学系研究科, 独立准教授 (50303938)
• 研究分担者: 吉川 秀樹 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (60191558) ; 岡本 美奈 大阪大学, 医学系研究科, 特任研究員 (50457008)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2008
• 研究課題ステータス: 完了 (2008年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2008年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2007年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 軟骨細胞 / 内軟骨性骨化 / トランスジェニックマウス / コラーゲン / 初期化因子 / 軟骨 / 骨形成 / 細胞分化 / 転写制御

研究概要

軟骨特異的発現をもたらすXI型コラーゲンα2鎖遺伝子(Collla2)のpromoter/enhancer配列にLacZとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子であるβgeo遺伝子を結合したトランスジーンコンストラクトを作製した。これを導入したトランスジェニックマウスを作製し、ラインを樹立した。このマウスの胎仔をX-galで染色すると、四肢と肋骨の軟骨原基のみが青く染まり、軟骨特異的にトランスジーンを発現していることが示唆された。このマウスの皮膚から線維芽細胞を、軟骨から軟骨細胞を初代培養した。培養にG418を添加すると、線維芽細胞は死滅したのに対し、軟骨細胞は生存した。Wild typeマウスから培養した軟骨細胞は死滅した。マウス培養軟骨細胞からRNAを抽出してcDNAを用意レトロウイルス発現ベクターに組み込んだcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーをβgcoトランスジェニックマウス由来線維芽細胞細胞に導入したところ、G418耐性のコロニーは得られなかった。そこで初期化因子(c-Myc, Klf4, 0ct3/4, Sox2)とSOX9、SOX5、SOX6のcDNAをレトロウイルスベクターに組み込んで発現ベクターを川意した。これらを線維芽細胞に導入し、細胞から蛋白を抽出し、western blot解析を行った。各初期化因子とSOX9の抗体を用いたところ、バンドを認めたため、発現ベクターが機能していることが判明した。初期化因子、SOX9と軟骨cDNAライブラリーを種々の割合で混合して、線維芽細胞に導入したところ、コロニーが出現した。このコロニーをピックアップし、クローニングした。クローニングした細胞はalcian blueに染まり、軟骨の表現型を持つことが示唆された。この細胞の解析を進めるために、細胞からRNAと蛋白を抽出した、本年度の研究により、Collla2-βgeoトランスジェニックマウスとレトロウイルス発現ベクターを組み合わせて用いることにより、線維芽細胞を軟骨細胞に誘導し得ることが示唆された.

研究成果

• [雑誌論文] Smad7 Inhibits Chondrocyte Differentiation at Multiplesteps during Endochondral Bone Formation and Down-regula tes P38 MAPK Pathways. (2008)
  • 著者名/発表者名: Iwai, T., Murai, J., Yoshikawa, H., Tsumaki, N
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 283 ページ: 27154-27164
  • 査読あり
• [雑誌論文] Insulation of the Ubiquitous Rxrb Promoter from the Cartilage-specific Adjacent Gene. (2008)
  • 著者名/発表者名: Murai, J., Ikegami, D., Okamoto, M., Yoshikawa, H., Tsumaki, N.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 283 ページ: 27677-27687
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characteristics of fracture and related factors in patients with rheumatoid arthritis. (2008)
  • 著者名/発表者名: Nampei, A., Hashimoto, J., Koyanagi, J., Ono, T., Hashimoto, H., Tsumaki, N., Tomita, T., Sugamoto, K., Nishimoto, N., 0chi, T., Yoshikawa, H.
  • 雑誌名: Mod. Rheumatol. 18 ページ: 170-176
  • NAID: 10024150369
  • 査読あり
• [雑誌論文] Low-intensity pulsed ultrasound increases bone ingrowth into porous hydroxyapatite ceramic (2007)
  • 著者名/発表者名: Iwai T, harada Y, Imura K, Iwabuchi S, Murai J, Hiramatsu K, Myoui A, Yoshikawa H, Tsumaki N
  • 雑誌名: J Bone Miner Metab 25 ページ: 392-399
  • NAID: 10024125465
  • 査読あり
• [学会発表] Smad7 inhibits chondrocyte differentiation at multiplesteps dur ing endochondra1 bone formation. (2008)
  • 著者名/発表者名: T. Iwai, J. Murai, K. Hiramatsu, D. Ikegami, M. Okamoto, H. Yoshikawa, N. Tsumaki
  • 学会等名: 7^<th> International Conference on Bone Morphogenetic Proteins
  • 発表場所: Lake Tahoe, CA, USA
• [学会発表] 内軟骨性骨化におけるBMPシグナルの作用 (2007)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 学会等名: 第14回BMP研究会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2007-07-22
• [学会発表] Inhibitory Smad6 and Smad7 Differently Regulate Cartilage Formation (2007)
  • 著者名/発表者名: T. Iwai, J. Murai, H. Yoshikawa, N. Tsumaki
  • 学会等名: 29th Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Resarch
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii, USA
• [学会発表] 内軟骨性骨化とBMPシグナル (2007)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 学会等名: 松本ボーンフォーラム
  • 発表場所: 松本
• [備考]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/dbcb/homepage/index.html