無細胞タンパク質合成系を利用した光受容膜タンパク質の発現法と機能解析への応用

• 研究課題/領域番号: 19770136
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 松山大学 (2008-2010); 独立行政法人理化学研究所 (2007)
• 研究代表者: 下野 和実 松山大学, 薬学部, 助教 (30415187)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2010
• 研究課題ステータス: 完了 (2010年度)
• 配分額: 3,990千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 690千円); 2010年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2009年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2008年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2007年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 膜タンパク質 / 大量発現 / ステロイド系界面活性剤 / 脂質二重膜 / フォトサイクル / ロドプシン / 光受容膜タンパク質 / 無細胞タンパク質合成 / リポソーム / キサントロドプシン / 界面活性剤 / 光誘起プロトン移動 / リボソーム / バクテリオロドプシン / フォールディング / 部位特異的ラベル / 非天然アミノ酸導入

研究概要

一般に膜タンパク質は,無細胞タンパク質大量合成は困難である.本研究では,透析法によりステロイド系界面活性剤除去・脂質二重膜形成・タンパク質合成を同時に行わせる無細胞タンパク質合成技術を開発した.本法では,バクテリオロドプシンの機能体を大量に合成(約0.5mg/mL反応液)でき,従来法に比べ5-25倍の収量であった.さらに生細胞系では,大量発現ができない海洋性藻類と好塩真正細菌由来のロドプシンの大量機能合成にも成功した.

研究成果

• [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成による膜タンパク質の生産 (2011)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 白水美香子, 横山茂之
  • 雑誌名: 生物物理 51(3) ページ: 128-129
  • NAID: 10029139965
  • 査読あり
• [雑誌論文] Photochemistry of a Putative New Class of Sensory Rhodopsin (SRIII) coded by xop2 of Haloarcular marismortu (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakao, Y., Kikukawa,T., Shimono, K., Tamogami, J., Kimitsuki, N., Nara, T., Unno, M., Ihara, K., Kamo, N.
  • 雑誌名: Journal of Photochemistry and Photobiology B 102 ページ: 45-54
  • 査読あり
• [雑誌論文] Photochemistry of a Putative New Class of Sensory Rhodopsin (SRIII) coded by xop2 of Haloarcular marismortui (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakao, Y., Kikukawa, T., Shimono, K., 他6名
  • 雑誌名: Journal of Photochemistry and Photobiology B 巻: 102 ページ: 45-54
  • 査読あり
• [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成系を活用した膜タンパク質合成方法 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 白水美香子, 横山茂之
  • 雑誌名: 実験医学 28(11) ページ: 1775-1780
• [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成系を活用した膜タンパク質合成法の開発 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 白水美香子, 横山茂之
  • 雑誌名: BIOINDUSTRY 27 ページ: 55-63
• [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成系を活用した膜タンパク質合成方法 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 白水美香子, 横山茂之
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 28(11) ページ: 1775-1780
• [雑誌論文] 無細胞タンパク質合成系を活用した膜タンパク質合成法の開発 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 白水美香子, 横山茂之
  • 雑誌名: BIO INDUSTRY 巻: 27(6) ページ: 55-63
• [雑誌論文] Production of functional bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free protein synthesis system supplemented with steroid detergent and lipid (2009)
  • 著者名/発表者名: Shimono, K., Goto, M., Kikukawa, T., Miyauchi, S., Shirouzu, M., Kamo, N., Yokoyama S.
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 2160-2171
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of functional bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free protein synthesis system supplemented with steroid detergent and lipid (2009)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono, Mie Goto, Takashi Kikukawa, Seiji Miyauchi, Mikako Shirouzu, Naoki Kamo, Shigeyuki Yokoyama
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 2160-2171
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of functional bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free protein synthesis system supplemented with steroid detergent and lipid (2009)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono, 他6名
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 2160-2171
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional overexpression of SMR-type multidrug transporter using cell-free protein synthesis system and analysis of interaction between transporter and its substrates by isothermal titration calorimetry (2008)
  • 著者名/発表者名: Shimono, K., Kikukawa, T., Nara, T., Someya, T., Shirouzu, M., Yokoyama, S., Miyauchi, S.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi Journal of The Pharmaceutical Society of Japan, (Suppl.2) 128 ページ: 139-140
• [雑誌論文] A long-lived M-like state of phoborhodopsin that mimics the active state (2008)
  • 著者名/発表者名: Sudo, Y., Nishihori, T., Iwamoto, M., Shimono, K., Kojima, C., Kamo, N.
  • 雑誌名: Biophysical Journal 95(2) ページ: 753-760
  • 査読あり
• [雑誌論文] Participation of the surface structure of Pharaonis phoborhodopsin, ppR and its A149S and A149V mutants, consisting of the C-terminal alpha-helix and E-F loop, in the complex-formation with the cognate transducer pHtrII, as revealed by site-directed C-13 solid-state NMR (2007)
  • 著者名/発表者名: Kawamura, I., Ikeda, Y., Sudo, Y., Iwamoto, M., Shimono, K., Yamaguchi, S., Tuzi, S., Saito, H., Kamo, N., Naito, A.
  • 雑誌名: Photochemistry and Photobiology 83(2) ページ: 339-345
  • 査読あり
• [学会発表] Thermodynamic characterization of interaction between small multidrug resistance transporter (EmrE) and its substrate at various pHs (2010)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono
  • 学会等名: Pharmaceutical Sciences World Congress 2010
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
  • 年月日: 2010-11-16
• [学会発表] Thermodynamic characterization of interacrion between small multidrug resistance transporter (EmrE) and its substrate at various pHs (2010)
  • 著者名/発表者名: Shimono, K., Someya, T., Shirouzu, M., Yokoyama, S., Miyauchi, S.
  • 学会等名: Pharmaceutical Sciences World Congress 2010
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
  • 年月日: 2010-11-16
• [学会発表] Thermodynamic study of pH dependence on interaction between small multidrug resistance transporter (EmrE) and its substrate (2010)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono
  • 学会等名: 日本生物物理学会第48回年会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2010-09-20
• [学会発表] Thermodynamic study of pH dependence on interaction between small multidrug resistance transporter (EmrE) and its substrate (2010)
  • 著者名/発表者名: Shimono, K., Someya, T., Shirouzu, M., Yokoyama, S., Miyauchi, S.
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2010-09-20
• [学会発表] 等温滴定型熱量計による多剤トランスポーターEmrEと基質との相互作用解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 第4回トランスポーター研究会九州部会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2010-09-11
• [学会発表] 多剤輸送担体EmrEと基質とのpH依存的相互作用変化の熱力学的特性 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 日本生物物理中国四国支部例
  • 発表場所: 松山
  • 年月日: 2010-05-08
• [学会発表] 多剤輸送担体EmrEと基質とのpH依存的相互作用変化の熱力学的特性 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 染谷友美, 白水美香子, 横山茂之, 宮内正二
  • 学会等名: 日本生物物理中国四国支部例会
  • 発表場所: 松山
  • 年月日: 2010-05-08
• [学会発表] 等温滴定型熱量計による多剤輸送担体EmrEと基質との相互作用解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 日本薬学会第130年会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2010-03-29
• [学会発表] SMR型多剤排出輸送担体と基質の相互作用に伴う熱量変化 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 日本生物物理学会第47回年会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2009-10-31
• [学会発表] SMR型多剤輸送担体と基質の相互作用に伴う熱量変化 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 日本生物物理学会第47回年会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2009-10-31
• [学会発表] SMR型多剤排出輸送担体と基質の相互作用に伴う熱量変化 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 他4名
  • 学会等名: 第47回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2009-10-31
• [学会発表] SMR型多剤排出タンパク質の無細胞大量機能発現および等温滴定型熱量計による基質との相互作用解析 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2009-08-07
• [学会発表] Na+共役型モノカルボン酸輸送担体(SMCT)に対する柑橘類抽出成分の効果 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 第4回トランスポーター研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2009-05-28
• [学会発表] Na^+共役型モノカルボン酸輸送担体(SMCT)に対する柑橘類抽出成分の効果 (2009)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 他3名
  • 学会等名: 第4回トランスポーター研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2009-05-23
• [学会発表] Functional Overexpression of Membrane Proteins Using Cell-free Protein Synthesis System Supplemented with Steroid Detergent and Lipid (2008)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) International Symposium 2008
  • 発表場所: Matsuyama, Japan
  • 年月日: 2008-09-26
• [学会発表] Functional Overexpression of Membrane Proteins Using Cell-free Protein Synthesis System Supplemented with Steroid Detergent and Lipid (2008)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) International Symposium 2008
  • 発表場所: Matsuyama
  • 年月日: 2008-09-26
• [学会発表] Functional Overexpression of Membrane Proteins Using Cell-free Protein Synthesis System Supplemented with Steroid Detergent and Lipid (2008)
  • 著者名/発表者名: Kazumi Shimono, 他4名
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) International Symposium 2008
  • 発表場所: 松山
  • 年月日: 2008-09-26
• [学会発表] SMR型多剤排出タンパク質の無細胞大量機能発現および等温滴定型熱量計による基質との相互作用解析 (2008)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 第30回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2008-08-07
• [学会発表] SMR型多剤排出タンパク質の無細胞大量機能発現および等温滴定型熱量計による基質との相互作用解析 (2008)
  • 著者名/発表者名: 下野和実, 他6名
  • 学会等名: 第30回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2008-08-07
• [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を利用した新規膜タンパク質機能発現系の開発 (2007)
  • 著者名/発表者名: 下野和実
  • 学会等名: 日本生物物理学会第45回年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-21
• [産業財産権] METHOD FOR PRODUCING MEMBRANE PROTEIN (2009)
  • 発明者名: Shigeyuki Yokoyama, Kazumi Shimono, Mikako Shirouzu, Mie Goto
  • 権利者名: RIKEN
  • 出願年月日: 2009-05-14
• [産業財産権] 2型ヒスタミン受容体タンパク質に結合し,かつ2型ヒスタミン受容体とヒスタミンとの結合を阻止し得るモノクローナル抗体 (2008)
  • 発明者名: 渡邊武,横山茂之,白水美香子,寺田貴帆,下野和実
  • 権利者名: 独立行政法人理化学研究所
  • 出願年月日: 2008-07-24
• [産業財産権] 膜タンパク質の製造方法 (2007)
  • 発明者名: 下野和実, 他3名
  • 権利者名: 理化学研究所
  • 産業財産権番号: 2007-286899
  • 出願年月日: 2007-11-05