| 研究概要 |
本研究においては、常磁性物質がタンパク質表面の13C核に対して誘起する常磁性シフトと、立体整列同位体標識法(SAIL標識法)を用いる事により、高分子量タンパク質複合体に対しても適用可能な、新しい蛋白質-蛋白質相互作用界面同定法を開発することを目的とした。解析対象としては、ユビキチン加水分解酵素(YUH)(C90S変異体)とユビキチン(ubi)の相互作用系をモデル解析系として用いた。YUHに対して安定同位体標識を導入し、観測対象とした。(1)サンプルの調製:無細胞発現系、および、アミノ酸要求性大腸菌を用いて、YUHに対して、SAIL標識Leu,Pheを導入する検討を行った。(2)YUHの13C由来シグナルの帰属:SAIL標識サンプル、uniform-2H,13C,15N 標識サンプル、50%-2H,uniform-13C,15N 標識サンプルを用いて、YUH、YUH-Ubi複合体の13C核由来シグナルの帰属を行った。シグナルの帰属は、HC(CO)NH、15N-NOESY-HSQC、13C-NOESY-HSQC等の3次元スペクトルを解析することにより行った。この結果、YUHに存在するLeu残基のメチル基(52個)の全てについて、シグナルを帰属することに成功した。(3)13C-NMR測定方法の検討:13C直接検出型実験であるCC-TOCSYについて、重水素デカップル等の測定条件の最適化について検討を行った。(4)常磁性シフトの測定:[SAIL-Leu]標識を導入したYUHについて、1H-13C相関スペクトルを測定した。この結果、[ul-13C-Leu]YUHと比較して高感度・高分解能のスペクトルが得られ、シグナルの縮重が回避された。さらに、ubiquitin結合に伴う常磁性シフト変化を解析した結果、YUH-ubiquitinの結晶構造において結合界面に存在するL44-Cδ1 に由来するシグナルについて、0.18ppmの常磁性シフトの減少が観測された。常磁性シフト解析の解析対象とする事が可能であった原子数は、[ul-13C-Leu]YUHでは27/52個(52%)であったが、[SAIL-Leu]においては、17/26(65%)であった。以上の結果から、SAIL、標識法の導入により、常磁性シフトを用いた相互作用解析法が、高分子量タンパク質に対して適用可能となることが示唆された。
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