時間分解構造解析を活用した一酸化窒素還元酵素の構造ダイナミクス研究

• 研究課題/領域番号: 19H00926
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 中区分37:生体分子化学およびその関連分野
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (70183051)
• 研究分担者: 村本 和優 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (50305679)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 45,110千円 (直接経費: 34,700千円、間接経費: 10,410千円); 2022年度: 11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円); 2021年度: 11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円); 2020年度: 10,790千円 (直接経費: 8,300千円、間接経費: 2,490千円); 2019年度: 11,960千円 (直接経費: 9,200千円、間接経費: 2,760千円)
• キーワード: 一酸化窒素還元酵素 / 一酸化窒素 / 脱窒 / 亜酸化窒素 / 抗菌ガス / 呼吸酵素の分子進化 / 抗菌剤開発 / 嫌気呼吸 / 髄膜炎菌 / 低温電子顕微鏡 / 時間分解構造解析 / 構造ダイナミクス / クライオ電子顕微鏡 / ナノディスク複合体 / 緑膿菌 / 時間分解解析 / 時間分解分光解析

研究開始時の研究の概要

脱窒菌の一酸化窒素還元酵素（NO消去酵素：NOR）は、鉄を活性中心に含む膜結合酵素であり、脱窒過程で中間生成物として現れる細胞毒性の高い一酸化窒素（NO）を速やかに消去している。地球環境保全、地球上での窒素循環、呼吸酵素の分子進化、病原菌の感染増殖などに関連する鍵酵素である。緑膿菌NOR、NOR-NiR複合体、髄膜炎菌NORとそれらの変異体を研究対象として、時間分解赤外分光と時間分解X線結晶構造解析を併用した測定により、NOR酵素反応中に現れる２つの短寿命反応中間体の電子状態ならびに配位構造（Fe-N-O）を決定する。それにより、NOR反応の分子機構を構造ダイナミクスを基盤に確立する。

研究成果の概要

膜結合型一酸化窒素還元酵素NORは、活性中心にヘム鉄と非ヘム鉄の複核中心を有し、嫌気呼吸の一種である脱窒において、その反応進行の鍵となる一酸化窒素NO還元反応を触媒する酵素である。また、病原菌の生活環においても重要な役割を果たしていることも知られている。本研究では、髄膜炎菌のqNORの単量体と二量体の分子構造を低温電子顕微鏡法で明らかにした。また、qNORと阻害剤との反応ならびに複合体の構造を詳細に解析した。緑膿菌のcNORとNOの反応を、時分割可視・赤外分光法を用いて詳細に解析し、NO還元反応の分子機構を確定した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

髄膜炎菌のqNORは、菌が宿主内でバイオフィルム内で嫌気呼吸をおこない、なおかつ宿主が産生する抗菌ガスNOを無毒化する上で、鍵となる酵素である。本研究で分子構造と反応プロトンの移動との関係、阻害剤との相互作用の詳細が明らかになったことにより、抗菌薬設計の基礎データとなる。また、緑膿菌cNORを用いた反応解析から、酵素反応の分子機構が提案でき、好気呼吸酵素との比較が可能となり、呼吸酵素の分子進化を議論できるようになった。さらに、NOR反応の生成物が、地球環境破壊に関係していることから、環境科学の観点からも今後注目される成果となった。

研究成果

• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Bristol/University of Leicester(英国)
• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Leeds(英国)
• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Leeds(英国)
• [雑誌論文] Trapping of a Mononitrosyl Nonheme Intermediate of Nitric Oxide Reductase by Cryo-Photolysis of Caged Nitric Oxide (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeda Hanae、Shimba Kanji、Horitani Masaki、Kimura Tetsunari、Nomura Takashi、Kubo Minoru、Shiro Yoshitsugu、Tosha Takehiko
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 127 号: 4 ページ: 846-854
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c05852
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis for heme detoxification by an ATP-binding cassette?type efflux pump in gram-positive pathogenic bacteria (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Hiro、Hisano Tamao、Rahman Md. Mahfuzur、Tosha Takehiko、Shirouzu Mikako、Shiro Yoshitsugu
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 号: 27
  • DOI: 10.1073/pnas.2123385119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Author Correction: Identifying antibiotics based on structural differences in the conserved allostery from mitochondrial heme-copper oxidases (2022)
  • 著者名/発表者名: Nishida Yuya、 et al., Shiro Yoshitsugu、Honma Teruki、Shigeta Yasuteru、Kubo Minoru、Takashima Seiji、Shintani Yasunori
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1
  • DOI: 10.1038/s41467-022-35600-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Capacity of extracellular globins to reduce liver fibrosis via scavenging reactive oxygen species and promoting MMP-1 secretion. (2022)
  • 著者名/発表者名: Hieu VN, Thuy LTT, Hai H, Dat NQ, Hoang DV, Hanh NV, Phuong DM, Hoang TH, Sawai H, Shiro Y, Sato-Matsubara M, Oikawa D, Tokunaga F, Yoshizato K, Kawada N.
  • 雑誌名: Redox Biol. 巻: 52 ページ: 102286-102286
  • DOI: 10.1016/j.redox.2022.102286
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 号: 21
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: - 号: 26 ページ: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Regulatory Switching by Concerted Motions on the Microsecond Time Scale of the Oxygen Sensor Protein FixL (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamawaki Takeo、Mizuno Misao、Ishikawa Haruto、Takemura Kazuhiro、Kitao Akio、Shiro Yoshitsugu、Mizutani Yasuhisa
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 125 号: 25 ページ: 6847-6856
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c01885
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatially restricted substrate-binding site of cortisol-synthesizing CYP11B1 limits multiple hydroxylations and hinders aldosterone synthesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Mukai Kuniaki、Sugimoto Hiroshi、Kamiya Katsumasa、Suzuki Reiko、Matsuura Tomomi、Hishiki Takako、Shimada Hideo、Shiro Yoshitsugu、Suematsu Makoto、Kagawa Norio
  • 雑誌名: Current Research in Structural Biology 巻: 3 ページ: 192-205
  • DOI: 10.1016/j.crstbi.2021.08.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of membrane protein-lipid interactions on formation of bilayer lipid membranes on SAM-modified gold electrode (2021)
  • 著者名/発表者名: Kato Masaru、Masuda Yuya、Yoshida Narumi、Tosha Takehiko、Shiro Yoshitsugu、Yagi Ichizo
  • 雑誌名: Electrochimica Acta 巻: 373 ページ: 137888-137888
  • DOI: 10.1016/j.electacta.2021.137888
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] NO Dynamics in Microbial Denitrification System (2021)
  • 著者名/発表者名: Tosha Takehiko、Yamagiwa Raika、Sawai Hitomi、Shiro Yoshitsugu
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 50 号: 2 ページ: 280-288
  • DOI: 10.1246/cl.200629
  • NAID: 130007986360
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 号: 1 ページ: 467-467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The active form of quinol-dependent nitric oxide reductase from Neisseria meningitidis is a dimer (2020)
  • 著者名/発表者名: Jamali M. Arif M.、Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Tosha Takehiko、Muramoto Kazumasa、Muench Stephen P.、Antonyuk Svetlana V.、Shiro Yoshitsugu、Hasnain Samar S.
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 7 号: 3 ページ: 404-415
  • DOI: 10.1107/s2052252520003656
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hanae Takeda, Tatsunari Kimura, Takashi Nomura, Masaki Horitani, Azusa Yokota, Akiko Matsubayashi, Shoko Ishii, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo and Takehiko Tosha
  • 雑誌名: Bulletin of the Chemical Society of Japan 巻: - 号: 7 ページ: 825-833
  • DOI: 10.1246/bcsj.20200038
  • NAID: 130007879554
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質・ヘム酵素の機能解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 雑誌名: BJSCC 巻: 75 ページ: 51-56
  • NAID: 130007879402
  • 査読あり
• [雑誌論文] UV Resonance Raman Characterization of a Substrate Bound to Human Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 (2019)
  • 著者名/発表者名: Sachiko Yanagisawa , Kure’e Kayama , Masayuki Hara , Hiroshi Sugimoto , Yoshitsugu Shiro , Takashi Ogura
  • 雑誌名: Biophysical Journal 巻: 117 号: 4 ページ: 706-716
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dimeric structures of quinol-dependent nitric oxide reductases (qNORs) revealed by cryo-electron microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Chiduza George N.、Tosha Takehiko、Yamamoto Masaki、Shiro Yoshitsugu、Antonyuk Svetlana V.、Muench Stephen P.、Hasnain S. Samar
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 5 号: 8
  • DOI: 10.1126/sciadv.aax1803
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Chemomechanical Coupling in the Transport Cycle of a Type II ABC Transporter (2019)
  • 著者名/発表者名: K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Sugita
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 123 号: 34 ページ: 7270-7281
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b04356
  • 査読あり
• [学会発表] Elucidation of Mechanisms for Catalytic Reaction of Nitric Oxide Reductases by Time-resolved Techniques (2022)
  • 著者名/発表者名: T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro and M. Kubo
  • 学会等名: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP-12)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular Mechanism of NO Reduction Catalyzed by Fe-containing Nitric Oxide Reductases (2022)
  • 著者名/発表者名: Y. Shiro
  • 学会等名: 8th Asian Conference on Coordination Chemistry (ACCC8)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 鉄の生体内動態の分子科学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第２回レドックスR&D戦略委員会 春のシンポジウム 最先端技術が切り拓くレドックスバイオロジー
  • 招待講演
• [学会発表] Time-resolved Techniques Provide Mechanism for Nitric Oxide Reduction by Nitric Oxide Reductase (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro and M. Kubo
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2021 (Pacifichem 2021)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明 生命金属科学への展開をめざして (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
  • 招待講演
• [学会発表] Probing Functional and Structural Differences of Quinol-dependent Nitric Oxide Reductases’ (qNOR) within a Lipidic Nanodisc Environment (2021)
  • 著者名/発表者名: C. Gopalasingam
  • 学会等名: Protein Science Society of Japan Annual Meeting
  • 招待講演
• [学会発表] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明：Functional Studies of Iron-Related Proteins on Molecular Basis (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 日本化学会第１０１春季年会
  • 招待講演
• [学会発表] 『生命金属科学』のめざすところ (2020)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: CSJ化学フェスタ
  • 招待講演
• [学会発表] Dynamics of Nitric Oxide in Bacterial Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • 著者名/発表者名: Shiro, Y.
  • 学会等名: Japan-BIOCEV Symposium: Macromolecules; Structure, Function and Beyond
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Dynamics of Nitric Oxide in Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • 著者名/発表者名: Shiro Y.
  • 学会等名: KTJ Bioinorganic Chemistry Symposium 2019 (KTJ-BICS 2019)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質の機能解明～生命金属科学への展開をめざして～ (2019)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 錯体化学会第69回討論会
  • 招待講演
• [学会発表] ヘム蛋白質の機能を司る構造・ダイナミクスとエネルギー流：実験と理論 (2019)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [図書] ヘムタンパク質の科学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣、青野 重利、齋藤 正男
  • 総ページ数: 472
  • 出版者: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 9784860437787
• [図書] 生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣・津本浩平
  • 総ページ数: 511
  • 出版者: NTS
  • ISBN: 9784860437060
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御学Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞膜超分子複合体機能解析学講座
  • URL: http://www2.riken.jp/biometal/index.htm
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [備考] 兵庫県立大大学院生命理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html