| 研究課題/領域番号 |
19H04029
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
山嶋 哲盛 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (60135077)
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| 研究分担者 |
及川 伸二 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (10277006)
山下 竜也 金沢大学, 先進予防医学研究センター, 准教授 (30334783)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)
2021年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2020年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2019年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
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| キーワード | ヒドロキシノネナール / リソソーム / Hsp70.1 / 細胞死 / 生活習慣病 / アルツハイマー病 / 非アルコール性脂肪性肝炎 / ２型糖尿病 / カルパインーカテプシン仮説 / サラダ油 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、世界的に様々な疾患モデルで追試されて来た研究代表者提唱の「カルパイン-カテプシン仮説」に基づき、オメガ６系の食用油を多量に摂るヒトに好発するアルツハイマー病や非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）及び２型糖尿病などの病因を、ヒドロキシノネナール（HNE）などの過酸化脂質に着目して究明する。すなわち、『酸化損傷（カルボニル化）とカルパイン切断がもたらすHsp70.1の異常に起因するリソソーム膜の破綻』をサルモデルで検証し、生活習慣病の根本原因を見直す。
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| 研究実績の概要 |
ω-６系のリノール酸を主成分とする食用油を揚げ物調理中に加熱すると、細胞毒性が強いヒドロキシノネナール(HNE)という過酸化脂質が生じる。同様に、生体内の細胞膜に取り込まれたリノール酸も種々の酸化ストレスで変性しHNEを作る。HNEはリソソーム膜を安定化する熱ショック蛋白Hsp70.1のカルボニル化をもたらし、Hsp70.1はカルパインによって切断され易くなる。その結果、リソソーム膜の透過性が亢進しカテプシンが漏出することが細胞死を惹起する（カルパインーカテプシン仮説）。該当年度では、毎週１回、５mgのHNEを半年間にわたり総計２５回サルに静脈内注射した後に、脳と肝臓、膵臓を組織学的に調べた。その結果、海馬CA-1の神経細胞死と肝細胞の壊死および膵臓β細胞の空胞変性がみられた。ウエスタンブロットではカルパインの活性化とHsp70.1の切断がみられ、免疫蛍光組織学的に活性型カルパインとHsp70.1は肝臓のKupffer細胞や神経細胞において共発現していた。以上から、HNEによるHsp70.1の機能障害が脳・肝・膵の細胞死を惹起することが示唆された。すなわち、リノール酸を主成分とするサラダ油が、アルツハイマー病や２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）などの生活習慣病の原因物質であると特定された。種々の生活習慣病の根本原因である細胞死は、実は虚血性神経細胞死と共通性の高い分子基盤によって生じている可能性が高い。そこで、「食用油由来のHNEやトランス脂肪酸などの過酸化脂質が、多種脂肪酸の受容体であるGPR40やHNEのレセプターであるGPR109Aを介して過剰のCa2+動員とカルパインの活性化をきたす。この活性型カルパインがカルボニル化Hsp70.1を切断するために、リソソーム膜が破れ細胞死を惹起する」という作業仮説の基づき、今年度も細胞死について継続的に検索を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒドロキシノネナール（HNE）の静脈内注射に伴う血液データの変動解析で、AST、ALTおよびΓGTPの有意な上昇がみられ、これが肉眼的および組織学的な肝細胞障害と一致した。また、HNE投与後の脳・肝臓・膵臓組織の形態学的解析によって、明らかな細胞変性と細胞死が見られた。HNEの投与前後の脳・肝臓・膵臓組織のウエスタンブロット解析によって、カルパインの活性化とHsp70.1の切断がみられた。さらに、電験的観察により、HNE投与後の脳・肝臓・膵臓組織において、リソソーム膜の透過性亢進/破裂がみられた。以上４点を確認し得たことにより、当初、予想していた通り、カルパインーカテプシン仮説で生活習慣病の根本原因である細胞死の分子メカニズムを説明できる目途がついたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の５項目を重点的に検索する。
１）HNE投与後の血液酸化度と抗酸化力の解析：HNEに代表されるヒドロペルオキシド（ROOH）を酸化ストレスのバイオマーカーとして測定する。２）HNEの静脈内注射に伴う血液データの変動解析：HNEの投与後１～６ヶ月目に耐糖能やHbA1c・血糖値・インスリン値・AST・ALT・中性脂肪・遊離脂肪酸の経時的変化を引き続き、追跡する。３）HNE投与前後の脳組織の形態学的解析：TUNEL法によって細胞死の数を定量化し、Hsp70.1とその関連蛋白・GPR40、GPR109AおよびカテプシンB・L・Dに対する抗体を用いて、免疫組織化学的局在を検索する。同時に、リソソーム膜の損傷の有無とその程度を電顕レベルで観察する。４）HNEの投与前後の脳組織のウエスタンブロット解析Hsp70.1とGPR40に対する抗体を用いて、それぞれの蛋白発現量を検索する。ことに、GPR40のagonistとantagonistを対照として、HNEによるGPR40やGPR109Ano活性化を評価する。Hsp70.1に対しては、抗カルボニル化抗体を用いて、カルボニル化Hsp70.1の発現変化を評価する。組織をリソソーム分画とサイトゾール分画とに分け、両者を比較しカテプシン酵素のリソソーム外への漏出の程度を解析する。５）HNE投与前後の機能プロテオミクス解析：２次元ディファレンスゲルでHsp70.1のスポットを切り出し飛行時間型質量分析(TOF-MS/MS)で調べる。蛍光標識・２次元ディファレンスゲル電気泳動で得られたHsp70のスポットは、CyDye DIGE Fluors染色後高精度で切り出し、トリプシンで消化後、TOF-MS/MSを行う。カルボニル化が増加したHsp70.1について、ペプチドマス・フィンガ-プリンティング法にて、酸化損傷部位を検出する。
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