| 研究課題/領域番号 |
19H04029
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
山嶋 哲盛 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (60135077)
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| 研究分担者 |
及川 伸二 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (10277006)
山下 竜也 金沢大学, 先進予防医学研究センター, 准教授 (30334783)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)
2023年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2022年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2021年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2020年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2019年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
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| キーワード | サラダ油 / ヒドロキシノネナール / 生活習慣病 / 細胞死 / リソソーム / Hsp70.1 / カルパイン / カテプシン / ランゲルハンス島 / β細胞 / μ-カルパイン / GPR109A / ペルオキシゾーム / ニホンザル / 視床下部 / 肝臓 / 膵臓 / アルツハイマー病 / 非アルコール性脂肪性肝炎 / ２型糖尿病 / カルパインーカテプシン仮説 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、世界的に様々な疾患モデルで追試されて来た研究代表者提唱の「カルパイン-カテプシン仮説」に基づき、オメガ６系の食用油を多量に摂るヒトに好発するアルツハイマー病や非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）及び２型糖尿病などの病因を、ヒドロキシノネナール（HNE）などの過酸化脂質に着目して究明する。すなわち、『酸化損傷（カルボニル化）とカルパイン切断がもたらすHsp70.1の異常に起因するリソソーム膜の破綻』をサルモデルで検証し、生活習慣病の根本原因を見直す。
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| 研究実績の概要 |
２１年度の研究においては、過酸化脂質であるヒドロキシノネナールをサルに毎週5mg、24週間にわたり注射し、ラ氏島のβ細胞に対する影響を調べた。その結果、対照群と比べて、ヒドロキシノネナールを注射したサルでは、組織学的にラ氏島細胞の空胞化が顕著にみられた。電子顕微鏡による観察では、この空胞はβ細胞やδ細胞に生じた粗面小胞体の拡張であり、β細胞に最も激しく次いでδ細胞においてみられた。しかも、β細胞においてはインスリン顆粒が、δ細胞においてはソマトスタチン顆粒が激減し、ミトコンドリアは著しい変性を示していた。いずれの細胞においてもペルオキシゾームやオートファゴゾームが増加しており、リソソームの限界膜は透過性の亢進や破裂を示した。変性したペルオキシゾームは、変性したミトコンドリアやオートリソソームの近傍にみられた。免疫蛍光組織化学による観察では、活性型の μ-カルパインとHsp70.1が共存しており、カテプシンBがリソソームの外に放出されていた。ウエスタンブロットでは、μ-カルパインの活性化バンドとHsp70.1の切断バンドが増加し、ヒドロキシノネナールの受容体であるGPR109Aの発現が確認された。
以上より、ヒドロキシノネナール注射後のサルにおいて、Hsp70.1の酸化とμ-カルパインの活性化が生じたことが示唆された。カルボニル化されたHsp70.1は活性化されたμ-カルパインによって切断され易くなる。その結果、リソソーム膜の破裂や透過性亢進が生じカテプシンBが細胞内に放出されるので、β細胞やδ細胞の変性が生じたものと解された。ヒドロキシノネナールによる酸化ストレスは、ペルオキシゾーム由来の活性酸素も増やした結果、両者が相俟ってインスリン顆粒やソマトスタチン顆粒が減ったものと推定された。ヒドロキシノネナールは、リソソームとオートファジーの異常を介し２型糖尿病の一因となり得る。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
近年、日本をはじめとする先進諸国では、脂肪肝、糖尿病、アルツハイマー病などの生活習慣病が激増している。本研究はHNEに起因するHsp70.1の異常が脂肪肝炎や２型糖尿病をはじめとする生活習慣病を惹起し得ることを、申請者らが提唱したカルパイン-カテプシン仮説に基づき、よりヒトに近い霊長類であるニホンザルを用いて証明するもので、HNEによる細胞障害機序が明らかになれば生活習慣病の新しい予防策や治療薬の開発につながる成果が期待できる。
２１年度は膵臓を対象とした研究を行い、脂肪酸の過酸化がもたらすヒドロキシノネナールによって、ラ氏島細胞が変性することを証明した。すなわち、以上より、ヒドロキシノネナール注射後のサルにおいて、Hsp70.1の酸化（カルボニル化）とμ-カルパインの活性化が生じたことが示唆された。カルボニル化されたHsp70.1は活性化されたμ-カルパインによって切断されやすくなる。その結果、リソソーム膜の破裂や透過性亢進が生じカテプシンBが細胞内に放出されるので、β細胞やδ細胞の変性が生じたものと解された。ヒドロキシノネナールによる酸化ストレスは、ペルオキシゾーム由来の活性酸素も増やした結果、両者が相俟ってインスリン顆粒やソマトスタチン顆粒が減ったものと推定された。したがって、脂肪酸に由来するヒドロキシノネナールは、リソソームとオートファジーの異常を介し糖尿病の一因となり得るものと思われた。肝臓についても既に興味ある結果が得られているがエビデンスは未だ不十分なので、次年度にかけて、HNEによる酸化損傷とカルパイン切断がもたらすHsp70.1の異常に起因するリソソーム膜破綻を肝癌培養細胞やCDAAマウスおよびHNEサルを用いて証明する。HNEによる肝細胞障害とこれに続く炎症・線維化への進展機序もHNE投与ニホンザルの経時的肝生検組織を用いて明らかにする。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)HNEによるリソソーム膜の破綻と細胞障害の証明：肝癌培養細胞であるHepG2とHuh7細胞を用いて、HNE投与後の経時的な生細胞率を測定するとともに、ライソトラッカー、LAMP2とカテプシンに対する抗体を用いてリソソームの形態変化を解析する。これらの実験において、HNEがリソソームの形態変化及び細胞死を引き起こす至適条件を決定する。
2)HNEによるHsp70.1のカルボニル化とμ-カルパインによる切断の誘導の証明：1)での至適条件下において、培養細胞より蛋白を抽出し、活性化カルパインであるカルパインとHsp70.1に対する抗体を用いて、活性型カルパインと切断されたHsp70.1のバンドを検出する。
3) HNEによるリソソーム膜の破綻と細胞障害経路の阻害実験：HNEの結合が予想されるGPR40、GPR109A等のGPCRに対するsiRNAを用いて、リソソーム膜の破綻と細胞障害が抑制されるかを検証する。また、カルパインやカテプシンBの阻害剤を用いた抑制実験を行い、HNEによるリソソーム膜の破綻と細胞障害の分子機序を同定する。上記1)～3)の検討は肝癌培養細胞で成功した後にiPS細胞から誘導した肝細胞においても確認する。さらに、以下の実験も合わせ行う。
４）NASH150例、単純性脂肪肝100例、背景肝が正常な大腸癌肝転移20例の肝組織を用いて電子顕微鏡による観察を行うと同時に、HNE LAMP2、カテプシンの免疫組織染色によるHNEとリソソーム膜破綻を示す肝細胞の関連を検証する。また、NASHマウスモデルを用いて、HNEによるリソソーム膜の破綻と肝細胞死を証明する。さらに、肝組織構成細胞の包括的single cell transcriptome 解析を用いて、肝細胞死から炎症誘導に関与する細胞の同定および分子機序を明らかにする。同様の解析をHNE投与マウスにおいても実施する。
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