| 研究課題/領域番号 |
19J10397
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分63020:放射線影響関連
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
多田 遥人 神戸大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2020年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2019年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | ヌクレオチド除去修復 / DNA損傷修復 / DNA損傷認識 / ヌクレオソーム構造 / タンパク質精製 / XPC |
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| 研究開始時の研究の概要 |
NERの基本的な分子機構はある程度明らかになってきている一方で「損傷をどのようにして効率よく認識し、修復しているのか」については不明な点が多い。これについて詳細なメカニズムを調べるため、無細胞系を用いた解析を行う。化学合成したDNA損傷を部位特異的に1か所含むDNA基質を用いて試験管内でヌクレオソーム構造を再構成し、これを基質として無細胞NER反応を行なって裸の損傷DNAを用いた場合の修復効率と比較する。ヌクレオソーム構造の形成よりNERは阻害されると考えられるが、これをアッセイ系としてヌクレオソーム構造によるNER反応の阻害を解除するタンパク質因子やヒストンの翻訳後修飾の探索を行う。
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| 研究実績の概要 |
ヌクレオソーム・ポジショニング配列として601配列を1コピー、その両側に5S rDNA配列を5コピーずつ導入したDNA基質を元に一本鎖環状DNAを調製し、損傷を含むオリゴヌクレオチドを601配列上にアニールさせる。これをプライマーとしてDNAポリメラーゼによる伸長反応、DNAリガーゼによる鎖連結反応を行うことで二本鎖環状DNA基質を作製し、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを用いた密度勾配遠心法により分離・精製した。このDNA基質と精製ヒストンタンパク質、ヒストンシャペロンNAP-1を用いて試験管内でアレイの再構成を行った。また、塩化マグネシウムを用いてヌクレオソームを凝縮させ、遠心により沈殿させて上清を除くことでヌクレオソームのみを精製した。
一方、ヌクレオソームに負の超らせんが蓄えられていることに着目しDNAの超らせん構造がNERに与える影響について調べるため、上記の方法で調製した二本鎖環状DNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、超らせん構造を解消する酵素のE.coli Topoisomerase I (Topo I)と逆に超らせん構造を導入する酵素のDNA gyrase (gyrase) を用いて実験を行った。上記の方法で二本鎖環状としたDNAはリラックスした状態にあるため、まずそこにgyraseを反応させて超らせん構造を導入してから無細胞NER反応を行った。その結果、リラックスしている状態と比べて損傷の切り出し効率が上昇した。また、このとき無細胞NER反応では切り出しが確認できていなかった損傷であるCPDの切り出しも確認された。さらに超らせん構造を導入したDNA基質に対してTopo Iを反応させてから無細胞NER反応を行うと損傷の切り出し効率が低下したことから、負の超らせん構造が切り出し効率を上昇させていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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