| 研究課題/領域番号 |
19J10858
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分38040:生物有機化学関連
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
浅野 早知 岐阜大学, 連合農学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2020年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2019年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | 細胞膜ドメイン / スフィンゴ糖脂質 / 光アフィニティラベル化 / 糖鎖 / 脂質ラフト / 光親和性プローブ / グロボ系列 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、未分化細胞に特異的に発現することが知られる、グロボ系列スフィンゴ糖脂質（GSL）を対象とし、脂質ラフト様の細胞膜ドメインの動的構造を明らかにすることを目指す。グロボ系列GSLと相互作用する脂質ラフトタンパク質分子が不明であるため、糖鎖末端に光反応基を導入したプローブを開発し、代表的な未分化細胞であるヒトiPS細胞を用いた生細胞膜上での光架橋実験と標的分子の構造解析を行い、細胞膜ドメインの構造を明らかとする。更に、グロボ系列GSLの糖鎖末端に蛍光分子を導入したプローブを用い、標的タンパク質との相互作用を一分子観察することにより、細胞膜ドメインの動態や分布を明らかとする。
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| 研究実績の概要 |
二年目は、一年目に開発した光反応性基「セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド」の特性評価及びスフィンゴ糖脂質プローブへの応用に注力し、以下の研究項目を実施した。
1. 新規光反応性基「セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド」の開発
モデル化合物であるα-マンノースアナログを用い、1H NMRを用いた水中におけるケトアミド構造の安定性評価、高速液体クロマトグラフィーを用いた光分解速度の解析を行い、従来型のチオフェン型構造と同等の水中安定性、光安定性を有することを示した。また、コンカナバリンAレクチンを用いたタンパク質親和性を等温滴定型カロリメトリーにより評価したところ、水素結合やファンデルワールス相互作用に基づく特異性の高い相互作用を示し、ケトアミド構造の導入によりタンパク質との親和性を妨げないことが示された。これらの結果を踏まえ、コンカナバリンAの光アフィニティラベル化を行い、標識化効率をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認したところ、高い標識化効率及び高選択的ラベル化を達成した。以上の結果より、セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド構造は光反応性基として有用である可能性が示唆された。
2. 光親和性GM3プローブの合成と細胞膜におけるラフト親和性タンパク質との光架橋実験
一年目に合成した、シアル酸9位アミノ基修飾型GM3骨格並びに、アルキン及び前述の光反応性基を有する光反応性基ユニットを用い、両者をカルバメート結合を介してカップリングし、光親和性GM3プローブの合成を達成した。A549細胞を用いた光架橋、アジド-アルキン環化付加反応によるビオチンタグの導入、ストレプトアビジンカラムを用いたGM3-標的タンパク質複合体のアフィニティ精製、プロテオミクス解析を行い、17種類の親和性タンパク質候補が同定された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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