| 研究課題/領域番号 |
19J13188
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分44050:動物生理化学、生理学および行動学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小野 宏晃 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2020年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2019年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 睡眠覚醒現象 / リン酸酵素 / 睡眠 / 覚醒 / ムスカリン型アセチルコリン受容体 / GPCR |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、ムスカリン型アセチルコリン受容体（M1とM3）の分子プロパティがレム睡眠を制御するという仮説を検証するものである。そのために、機能改変型M1・M3をスクリーニングし、個体内に機能改変型M1・M3を導入することで、分子プロパティと睡眠表現型との因果関係を個体レベルで示す。
まず、in vitroアッセイ系で機能改変型M1・M3をスクリーニングする。次に、CRISPR-Cas9を用いてM1・M3のゲノムを機能改変型に編集する。次に、遺伝子改変個体の脳波・筋電図を測定し、分子プロパティと睡眠表現型の因果関係を検証する。さらに、遺伝薬理学的な直接摂動を与えることで構成的な検証を行う。
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| 研究実績の概要 |
本年度は、前年度に樹立したアデノ随伴ウイルス（AAV）による遺伝子過剰発現系の課題であった非生理的な空間的発現パターンを解決するために、内在性のプロモーター/エンハンサー領域を予測することを試みた。そのために、公開されているシングルセル解析（scATAC-seq）のデータと解析プラットホーム（Seurat）を用いてM1とM3の近傍におけるクロマチンアクセシビリティが高いゲノム領域をあぶり出すことに成功した。このゲノム領域はプロモーターまたはエンハンサー領域である可能性が高いため、その下流にM1/M3とその変異体を搭載したAAVを作製し表現型解析を行う予定である。
一方で、M1/M3シグナルと関連する可能性のあるリン酸化酵素を同定し、その睡眠覚表現型への影響も調べた。まず、汎細胞的に発現させるプロモーターを用いてリン酸化酵素を発現させると覚醒状態が安定化し、結果的に覚醒時間が延長することが判明した。さらに、リン酸化酵素自体のリン酸化状態が覚醒延長効果に影響する可能性を考えて、網羅的なリン酸化模倣変異体スクリーニングを実施した。そのために全75種類のセリン/スレオニン残基をグルタミン酸に置換（リン酸化模倣）した変異体を作製し、AAVによって過剰発現させた。その結果、これまでに報告されていない残基のリン酸化模倣によって覚醒時間が延長することを明らかにした。次に、リン酸化酵素の標的分子を同定するために、当該リン酸化酵素遺伝子のノックアウトマウスとリン酸化酵素の過剰発現マウスからサンプリングを行い、リン酸化プロテオミクス解析を行った。この解析は現在進行中であるが、いくつかの神経細胞の活性調節に関わる分子のリン酸化が変動していることが判明している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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