| 研究課題/領域番号 |
19J14315
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分34020:分析化学関連
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
水田 巽 大阪府立大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2020年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2019年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | 色素液体 / 可塑化PVC膜 / 酵素活性アッセイ / 免疫測定 / マイクロ分析デバイス / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、まず免疫測定で用いられる重要酵素であるALPを選択的かつ高コントラストに検出できる「酵素反応性色素液体」を開発し、これとPVCからなる可塑化PVC膜を用いて、変色を利用したALPの画像検出を行う。
次に、マイクロ分析デバイスへの「酵素反応性色素液体」製PVC膜の固定、ハイドロゲル膜の積層、及び可溶性酵素標識抗体膜の固定により、高コントラスト画像検出型1ステップ免疫測定デバイスを開発する。
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| 研究実績の概要 |
本年度は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく蛍光増強を利用した酵素応答性PVC膜光センサーの開発に着手し、まずFRETに基づく蛍光増強を利用したPVC膜センサーの高感度化を検証した。ドナーとしてピレン誘導体アニオンと4級ホスホニウムカチオン（P66614）から成る色素液体、アクセプターとしてアルキル化フルオレセイン（FL）アニオンとP66614から成る色素液体を用いて、イオン検出の高感度化を試みた結果、少量のアクセプターを含むドナー用色素液体製PVC膜において、同じ膜厚の従来型PVC膜に対して約20倍の蛍光感度を達成した。
次にアクセプターをリン酸化FL誘導体に変更し、アルカリフォスファターゼ検出を試みたが、基質の加水分解安定性の低さに起因して、高感度な酵素検出が困難だった。改善案のベータガラクトシダーゼ（βGal）とアルキル化βGal用FL基質の組み合わせでは反応が進まないことがわかり、基質の拡散しにくさ、高親水性部位を持つ大過剰のドナーが原因として挙げられた。
解決には、中性のドナー用疎水性色素の利用、疎水性材料のナノ粒子分散化に基づく界面反応の効率向上が必要だと考え、ドナー用色素のヘキサフェニルシロールと、ポリエチレングリコール系界面活性剤から成るナノ粒子を検討した。アルキル化βGal用FL基質を添加した粒径約100nmの粒子を用いて酵素応答を調査した結果、明瞭なFRET型応答が得られた。非FRET系との比較では、同じ基質濃度・応答時間で約6倍の感度が得られ、ナノ粒子化技術の利用により界面反応に基づく高感度酵素検出を実現した。
本研究では、界面酵素反応検出のための有効な知見が数多く得られ、分析デバイス展開への道筋が示された。今後、①ハイドロゲル中への粒子の分散・固定、②抗原固定化粒子に基づく競合型ELISAの継続的な検討で、分析デバイス開発が実現できると考えられる。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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