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イヌジステンパーウイルスの病原性解析と遺伝子治療への応用

研究課題

研究課題/領域番号 19J14751
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
審査区分 小区分42020:獣医学関連
研究機関山口大学

研究代表者

南 昌平  山口大学, 連合獣医学研究科, 特別研究員(PD)

研究期間 (年度) 2019-04-25 – 2021-03-31
研究課題ステータス 完了 (2020年度)
配分額 *注記
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2020年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2019年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
キーワードイヌジステンパーウイルス / リバースジェネティクス / ウイルスベクター / 感染性クローン
研究開始時の研究の概要

犬ジステンパーウイルス(CDV)の感染性クローンを作製し、ヘマグルチニン蛋白の変異やCDV株間の差異による様々な宿主細胞株への感染能、増殖性を比較解析することで病原性を明らかにする。また、CDVのリンパ球への高い感染能を保持したミニゲノム内包ウイルスを作製し、目的の蛋白を発現させ細胞死を誘導させる。これにより世界初のリンパ球への遺伝子導入法を確立し、H蛋白に変異を加え、リンパ腫への特異性を高めることにより、悪性リンパ腫の安全な特異的治療法を確立する。

研究実績の概要

昨年に確立したイヌジステンパーウイルス(CDV)のリバースジェネティクス系を応用させ、ウイルスベクターとして細胞への遺伝子導入を試みた。始めに、CDVのウイルスゲノム内全ORFの欠損体作製を試みた。T7プロモーター、ハンマーヘッド型リボザイム、D型肝炎ウイルスリボザイムおよびT7ターミネーターを含むプラスミドベクターにCDVの5'UTRと3'UTR間にEGFP発現遺伝子をクローニングした。得られたプラスミドをCAGプロモーターによる全CDV蛋白発現プラスミドと共にBHK/T7-9細胞へトランスフェクションし、培養上清を回収した。その後、培養上清をA72/cSLAM細胞へと接種し、EGFP蛋白の蛍光を観察した。結果、EGFPのシグナルは得られなかった。
パラミクソウイルス科は各ORFの上流UTRにあるgene start(GS)、下流UTRにあるgene end(GE)と呼ばれるシグナル配列を認識してウイルスポリメラーゼが転写を開始、終止することが知られている。本実験ではGSはCDV N遺伝子のものであり、GEはCDV L遺伝子のものであったため、転写が行われなかったと考えられた。そこで、GEの配列をN遺伝子のものに置換したプラスミドを作製し、同様の実験を行ったが、EGFPのシグナルは得られなかった。GS、GEの配列の組み合わせやCDVのパッケージングシグナル配列の欠如が原因と考えられた。
次にH遺伝子欠損CDVの作製を試みた。H遺伝子をEGFP遺伝子に置換したCDVゲノムを感染性粒子作製と同様の手法に加え、H蛋白を過剰発現させ実施したが、EGFPのシグナルは得られなかった。しかしながら、上清を用いたウエスタンブロットによる抗原検出ではF蛋白が検出されたため、EGFP遺伝子が発現していないことが考えられた。上述のGS、GEやコドンの最適化などが改善点として挙げられる。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2020 実績報告書
  • 2019 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2021 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件)

  • [国際共同研究] Kasetsart University(タイ)

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [雑誌論文] A serological survey and characterization of Getah virus in domestic pigs in Thailand, 2017‐20182021

    • 著者名/発表者名
      Rattanatumhi Khwankamon、Prasertsincharoen Noppadol、Naimon Nattakarn、Kuwata Ryusei、Shimoda Hiroshi、Ishijima Keita、Yonemitsu Kenzo、Minami Shohei、Supriyono、Tran Ngo Thuy Bao、Kuroda Yudai、Tatemoto Kango、Mendoza Milagros Virhuez、Hondo Eiichi、Rerkamnuaychoke Worawut、Maeda Ken、Phichitraslip Thanmaporn
    • 雑誌名

      Transboundary and Emerging Diseases

      巻: - 号: 2 ページ: 913-918

    • DOI

      10.1111/tbed.14042

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 国際共著
  • [雑誌論文] Histopathological Characterization of Cases of Spontaneous Fatal Feline Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, Japan.2021

    • 著者名/発表者名
      Yusuke Sakai, Yuko Kuwabara, Keita Ishijima, Saya Kagimoto, Serina Mura, Kango Tatemoto, Ryusei Kuwata, Kenzo Yonemitsu, Shohei Minami, Yudai Kuroda, Kenji Baba, Masaru Okuda, Hiroshi Shimoda, Masashi Sakurai, Masahiro Morimoto, Ken Maeda
    • 雑誌名

      Emerging infectious diseases

      巻: 27 号: 4 ページ: 1068-1076

    • DOI

      10.3201/eid2704.204148

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス

URL: 

公開日: 2019-05-29   更新日: 2024-03-26  

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