研究課題
特別研究員奨励費
DNAメチル化は遺伝子発現の抑制に関与する重要なエピジェネティック修飾であり、分化した細胞では複製・細胞分裂を経て正確に受け継がれる。複製の直後に起こるDNA維持メチル化には、ユビキチンE3リガーゼUHRF1とDNAメチル化酵素DNMT1が必須であることが明らかとなっているが、複製とどのように連携しているかは不明である。そこで本研究では、DNA維持メチル化を制御する複製因子の構造生物学的な研究に取り組み、複製と連携したDNA維持メチル化の構造基盤の解明を目指す。
本研究では、複製因子PAF15が関与する複製と連携したDNA維持メチル化の構造生物学的な解明を目的とした。今年度は、DNAポリメラーゼδを加えたPAF15を含む複製サイトで形成されるタンパク質-DNA複合体 (①) と、ユビキチン化PAF15によるDNAメチル化酵素DNMT1の活性化機構の解明を目指し、ユビキチン化PAF15、DNMT1、DNAの3者複合体 (②) について解析を行った。①に関しては、昨年度までに、PAF15を含む複製サイトで形成されるタンパク質-DNA複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行った。その結果、複合体がDNAから解離していることが明らかになった。そこで、今年度はDNAポリメラーゼδを新たなコンポーネントとして複合体に加え、複合体からのDNAの解離を防ぐことにした。この複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析の結果、複合体からのDNAの解離を防ぐことには成功したが、複合体の柔軟性が高く、高分解での複合体構造の決定には至らなかった。今後、複合体中のDNAの再設計や複合体の架橋で、より高分解能での構造解析が可能であると考えている。②に関しては、昨年度までに、単体で自己活性阻害型のDNMT1がユビキチン化PAF15の結合で活性化することを生化学的な実験で明らかにした。今年度は、ユビキチン化PAF15の結合によるDNMT1の活性化機構の構造生物学的な解明に向けて、ユビキチン化PAF15、DNMT1、DNAの3者複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、予備的なデータの取得に成功した。今後、複合体の調製方法を改善し、高分解能な立体構造情報からユビキチン化PAF15の結合に伴うDNMT1の構造変化を明らかにする。これにより、DNMT1の活性化機構の解明につながると考えている。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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