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基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発

研究課題

研究課題/領域番号 19J23669
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
審査区分 小区分38020:応用微生物学関連
研究機関名古屋大学

研究代表者

唐澤 昌之  名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)

研究期間 (年度) 2019-04-25 – 2022-03-31
研究課題ステータス 完了 (2021年度)
配分額 *注記
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2021年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2020年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2019年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
キーワードバイオ触媒 / 菌体触媒 / シトクロムP450 / 酸化反応 / デコイ分子 / 擬似基質 / 大腸菌 / ポリン
研究開始時の研究の概要

ベンゼンに代表される不活性な石油由来炭化水素を、より有用な化合物へと変換する菌体触媒の開発を行う。シトクロムP450BM3は長鎖脂肪酸の水酸化酵素であり、基質模倣物(擬似基質)によって基質選択性を変換できる。本研究では、P450BM3を過剰発現させた大腸菌に擬似基質を取り込ませることで、菌体内で基質の水酸化が進行する新規反応系を構築する。また、擬似基質の構造を調整し、菌体反応に有効な擬似基質の創製や、菌体自身が擬似基質を生産する反応開発を目指す。

研究実績の概要

水酸化酵素であるP450BM3 (BM3) は、擬似基質(デコイ分子)によって基質特異性を変換できる。これまでに、BM3を発現させた大腸菌にデコイ分子を取り込ませることで、菌体内の補酵素再生系を利用して非天然基質の水酸化が進行することを明らかにしている。また、外膜タンパク質OmpFの変異体をBM3と共発現させることで、菌体反応が促進されることを見出している。OmpF変異体の機能を精査するため、ピレンを部分骨格として有するデコイ分子を模した蛍光分子を合成し、大腸菌への取り込みを評価した。蛍光分子を大腸菌の懸濁液に加えてインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、OmpF変異体を発現させた大腸菌からのみ明瞭な蛍光が観測された。また、培養後の上清の紫外可視吸収スペクトルを測定し、蛍光分子の吸収から菌体への取り込み効率を算出したところ、野生型OmpFを発現させた大腸菌では取り込み効率が11%であったのに対し、OmpF変異体を発現させた場合では74%に増加した。以上の結果から、OmpF変異体が擬似基質の取り込みを促進していることが示唆された。また、天然物が擬似基質として機能するかを調査するため、アシルホモセリンラクトン(CnHSL)とアシルホモセリン(CnHS)の存在下、BM3によるベンゼンの水酸化を行った。AHSLの中では炭素鎖8のものが、AHSの中では9のものが酵素反応を効果的に促進し、C9HSの存在下、BM3は毎分24回ベンゼンを酸化した。X線結晶構造解析から、C12HSLのラクトン環はC16HSのカルボキシ基よりもBM3の基質結合部位の奥に固定化されていることが明らかとなり、酵素反応で観測された鎖長依存性の差は、両者の結合状態の違いに起因していると推測している。菌体自身がデコイ分子を生合成する新しい菌体触媒の開発につながることが期待される。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(3件)
  • 2021 実績報告書
  • 2020 実績報告書
  • 2019 実績報告書
  • 研究成果

    (6件)

すべて 2022 2020 2019

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 3件)

  • [雑誌論文] Designer Outer Membrane Protein Facilitates Uptake of Decoy Molecules into a Cytochrome P450BM3-Based Whole-Cell Biocatalyst (English ver.)2022

    • 著者名/発表者名
      M. Karasawa, K. Yonemura, J. K. Stanfield, K. Suzuki, O. Shoji
    • 雑誌名

      Angew. Chem. Int. Ed.

      巻: 64(7) 号: 7

    • DOI

      10.1002/anie.202111612

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 外部添加物によるP450BM3の活性化を利用した菌体内での炭化水素の直接酸化2020

    • 著者名/発表者名
      唐澤昌之、米村開、鈴木和人、ジョシュア・カイル・スタンフィールド、柳澤颯太、渡辺芳人、荘司長三
    • 学会等名
      日本化学会 第100春季年会 (2020)
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] Direct Hydroxylation of Benzene to Phenol Catalyzed by the Whole-Cell Biocatalyst Utilizing Substrate Misrecognition of P450BM32019

    • 著者名/発表者名
      M. Karasawa, K. Suzuki, J. K. Stanfield, S. Yanagisawa, Y. Watanabe, O. Shoji
    • 学会等名
      19th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC-19)
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Direct Hydroxylation of Benzene to Phenol Catalyzed by the Whole-Cell Biocatalyst Utilizing Substrate Misrecognition of P450BM32019

    • 著者名/発表者名
      M. Karasawa, K. Suzuki, J. K. Stanfield, S. Yanagisawa, Y. Watanabe, O. Shoji
    • 学会等名
      15th International Symposium on Applied Bioinorganic Chemistry (ISABC15)
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Designing the Whole-Cell Biocatalyst for Hydroxylation of Benzene to Phenol Utilizing the Malfunction of Cytochrome P450BM32019

    • 著者名/発表者名
      M. Karasawa, K. Suzuki, J. K. Stanfield, S. Yanagisawa, Y. Watanabe, O. Shoji
    • 学会等名
      The 29th Symposium on Role of Metals in Biological Reactions, Biology and Medicine (SRM2019)
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 擬似基質による脂肪酸水酸化酵素の活性化法に基づく菌体触媒の開発2019

    • 著者名/発表者名
      唐澤昌之、鈴木和人、ジョシュア・カイル・スタンフィールド、柳澤颯太、渡辺芳人、荘司長三
    • 学会等名
      第19回日本蛋白質科学会年会第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書

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公開日: 2019-05-29   更新日: 2024-03-26  

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