| 研究課題/領域番号 |
19J40312
|
|---|
| 研究種目 |
特別研究員奨励費
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 国内 |
|---|
| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
|
|---|
| 研究機関 | 高知大学 |
|---|
研究代表者 |
山口 亜利沙 高知大学, 教育研究部医療学系, 特別研究員(RPD)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-10-01 – 2023-03-31
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2022年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2019年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
|
|---|
| キーワード | ガレクチン / 非古典的分泌経路 / EMARS / プロテオミクス / 分子会合 / 非古典的経路分泌 |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、積年の謎であるガレクチンの細胞外分泌機構の解明を目指し、申請者が独自に開発した発現HRP融合タンパク質による高特異性EMARS法を用いてガレクチン３の分泌を司る分子群を網羅的に突き止める。この際、種々の分泌条件下にて細胞内小胞及び細胞膜上のガレクチン３会合分子群を同定することで、分泌経路を特定する。さらに、個々のガレクチン３会合分子を欠失させて、ガレクチン３分泌への影響を評価し、ガレクチン３の細胞外分泌に必要な分子を明らかにする。本研究によりガレクチン分泌機構解明に突破口を開くことができれば、ガレクチンが寄与するがん細胞の増殖、進展を制御するための基盤的知見を得ることができる
|
| 研究実績の概要 |
独自に開発した第２世代EMARS法を用いて、積年の謎であるガレクチンの細胞外分泌機構の解明に挑んだ。ガレクチン３の分泌に寄与する分子を見つけるために、ガレクチン３の分泌を制御する薬剤の探索、ガレクチンとEMARS反応触媒酵素のキメラタンパク質の発現、ガレクチン３と会合する分子の同定を計画し、研究を進めた。昨年まで、ガレクチン３変異体（R186S）は分泌が抑制されることや、コレステロール輸送体阻害剤U18666A処理によりガレクチン３濃縮小胞が形成され分泌が促進されることを見出した。これら分泌速度の異なる諸条件について、発現mCherry-APEX-ガレクチン３を用いたEMARS反応を行い、SILAC法によるサブトラクション解析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、アクチン結合関連分子(αactinin-4,Caplin-1,Transgelin-2, cortactin, FilaminA,Profilin-1） が多数検出された。さらに、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンにより、ガレクチン３の分泌が抑制された。また、ガレクチン３の分泌が促進されるU18666Aを添加した条件においてもSILAC法による質量分析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、Rab5が同定された。Rab5を免疫染色し、共焦点顕微鏡にて観察したところ、U18666A添加時に形成される濃縮小胞と一致した。これらのことから、アクチン結合関連分子およびRab5がガレクチン3の分泌に関与している可能性が示唆された。なお、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として内在的に発現するガレクチン３自体が検出されたので、EMARS法の実験系はうまく機能していると思われた。
|
| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
|
