| 研究課題/領域番号 |
19K05534
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分34020:分析化学関連
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| 研究機関 | 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛 |
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研究代表者 |
武井 史恵 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 進学課程, 准教授 (30252711)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2021年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2020年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2019年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 核酸 / EIS / グラッシーカーボン / 電気化学 / DNA特殊構造 / DNA / 小分子リガンド / PCR / RNA / 蛍光分子 / DNA結合分子 / 炭素電極 / 遺伝子検出 / リガンド |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本課題研究では、申請者の独自技術であるDNAの特殊構造に特異的に結合する“小分子リガンド”を使った遺伝子蛍光検出法を基盤とした新しい電気化学的な手法を用いた生体分子計測法を構築する。インピーダンス(EIS)を用い、DNAと小分子リガンドの相互作用の変化を電気シグナルとして検出する方法の開発を目指す。開発した遺伝子検出法がDNA, RNAの定量的な検出に応用可能であることを示すため、1）小分子リガンドを固定化した電極の開発と基本原理の実証、2）遺伝子増幅反応組み合わせた高感度測定、3）21-25塩基長のmiRNAの検出法の確立、実証を行う
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| 研究実績の概要 |
これまでにDNAの特殊構造を特異的に蛍光検出する方法について検討を行なってきた。すでに小分子リガンドとしてDNAのシトシンバルジ構造(C-バルジ構造）に特異的に結合し、特徴的な蛍光を示すDANPを用いた核酸の新しい検出法について検討している。この研究課題では、新たにDANPとインピーダンス分光法（EIS法）を組み合わせて高感度の検出法の開発を検討した。EIS法では電極と[Fe(CN)6]3-/4-の間で電子の授受が行われ、その間の抵抗をシグナルとして検出する。我々は、ここにDNAPをメディエーターとして加えることを考えた。DANPを加えると電極と[Fe(CN)6]3-/4-の間にDANPが入り、大きくその抵抗値が変わる。グラッシーカーボン塗布電極を用い、[Fe(CN)6]3-/4- 3 mMとDANP 3μM を含むpH7.0のリン酸バッファーにC-バルジ構造のDNAを加えていくと、DNA添加前に比べて抵抗値が大きく変化することがわかった。一方、完全相補的なDNAの場合、DNAの添加前後で抵抗値はほとんど変わらないことから、このEISスペクトルの変化は、電極表面の近くに存在していたDANPがC-バルジ構造と結合して電極表面から遠ざかることによる変化と考えられる。また、他のアデニン、チミン、グアニンバルジ構造ではシグナルの変化が完全相補的なDNAとほぼ同じであったことから、この方法によりC-バルジ構造を持つDNAを特異的に検出できることが示唆された。
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