| 研究課題/領域番号 |
19K05785
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
橋本 賢一 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70508382)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2020年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2019年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | メカノセンシティブチャネル / 核酸 / イノシン酸 / MscL / 分子動力学シミュレーション / )物質排出担体 / パッチクランプ法 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
排出担体の性能向上は微生物による物質生産における生産性の向上に寄与する。物質生産に有用な排出担体の特性を明らかにするため、MscLを基礎とした新規汎用的物質排出担体の創製を行う。手段として以下に示す4つの研究ステージを繰り返す。
①開口性の向上したMscL変異体を作成し、代謝関連酵素増強株に導入する。
②変異型MscL導入株の物質生産性を評価する
③パッチクランプ法を用いた変異型MscLの機能解析
④分子動力学シミュレーションを用いた変異型MscLの機能解析と変異型MscLのリデザイン
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| 研究実績の概要 |
MscLは細胞膜の張力の上昇により細胞膜膜面水平二次元方向へ牽引され、ある閾値を超えた時に開口するメカノセンシティブチャネルの一種である。本研究では有用物質の生産に資するMscLを基とした新規物質排出担体の開発を目指すが、その機能を明確にするためには細胞外の目的物質濃度と対をなす細胞内の濃度を知る必要がある。
工業的グルタミン酸生産に用いられるCorynebacterium glutamicumは細胞内で合成したグルタミン酸を細胞外へ排出する主要な単体としてMscLと同じメカノセンシティブチャネルであるNCgl1221チャネルが知られている。このチャネルは機能向上型変異体であるA111VとW15CSLWが知られている。申請者らは、これらの変異体を大腸菌を親株とした核酸生産株に導入することで核酸の生産性が向上することを見出した。
これらの株をモデルとして用い、細胞内の核酸濃度を安定的に測定する実験系の構築を行うことにした。細胞内の核酸測定を行うにあたり、細胞外と細胞内の核酸を明確に分離するため、細胞洗浄が必須であると考えられる。しかし、メカノセンシティブチャネルは低浸透圧ストレスに応じて開口するため、培養時と洗浄時の浸透圧差の影響が細胞内核酸濃度に大きな影響を及ぼす可能性が非常に高い。細胞洗浄液として用いるBufferの組成と浸透圧を種々検討した結果、比較対象株と比べ、A111V変異体、W15CSLW変異体を導入した核酸生産性向上株にて細胞内核酸濃度が低下していることを確認した。このことはメカノセンシティブチャネルの開口性が向上することで細胞内に核酸が蓄積しにくくなり、核酸の生合成が行いやすくなっている可能性が考えられる。
これはMscL変異体導入株においても同様の現象が惹起されている事が予想され、細胞内核酸濃度をモニタリングすることが重要であることを示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症の5類移行後の病院関連業務増加と、新形態業務への対応のため十分な検討実験を行う時間の確保が難しかった事、および微生物パッチクランプ装置が設置されている施設の大幅な人員変更のため、目的達成のための目論見を再検討する必要があったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
使用を予定していたパッチクランプ装置と同等の性能を持つ設備を持つ別施設があり、使用を打診している。現在その施設では装置のセットアップが終わっていない状況であるため、装置のセットアップと性能の検証を行った後に機能向上型の排出担体を持っていると考えられる株を用いた解析を行う。
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