| 研究課題/領域番号 |
19K06243
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 |
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研究代表者 |
伏屋 玲子 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(長崎), 主任研究員 (40373469)
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| 研究分担者 |
坂本 崇 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (40313390)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2020年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2019年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | クルマエビ / 性連鎖SNPマーカー / RNA抽出 / RNA-seq解析 / ポストラーバ / 性決定 / GRAS-Di解析 / 性連鎖マーカー / リファレンス / 発生段階 / 性分化 / 家系 / 閉鎖循環型飼育 / 性決定機構 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
クルマエビの性差（雌＞雄）に着目し，性統御・全雌生産の可能性を検討するために性決定機構および性分化機構について解析する．これまでに開発した性連鎖マーカーを利用し，初期発生段階を継時的にサンプリングし，性連鎖マーカーにより各個体の性別を判定する．性別判定をした雌雄個体のRNAをそれぞれまとめ，RNA-seq解析を実施し，ごく初期に遺伝子発現の雌雄差が現れる遺伝子を性決定候補遺伝子として単離する．これらの候補遺伝子について，解析済みの家系における性連鎖解析を行い，性決定遺伝子の探索を行う．また，この継時的なサンプルによるRNA-seq解析により性分化機構に関与する遺伝子群も明らかにする．
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| 研究実績の概要 |
2020年に飼育下のクルマエビ雌個体から，自然産卵で採集した受精卵をもとに生産した家系において，ポストラーバ（PL)に変態後，数日ごとにサンプリングした冷凍サンプルについてDNAおよびRNAの抽出を行った。固定液として使用したISOGEN（ニッポンジーン）のプロトコールに従い，各個体からまずRNAを抽出し，残りの溶液からDNAを抽出した。予備試験で抽出が確認されたPL37から時期を遡り，後半のステージ（PL30，PL21）については生殖器部位の形成を推定した腹部をピンセットとハサミで切り出し，前半のステージ（PL15，PL12）についてはホールサンプルを用いた。PL30，PL21，PL15，PL12サンプルについてはそれぞれ個別にRNA，DNA抽出を行うことができたことから，DNAサンプルについては，これまで開発した性連鎖SNPマーカーを用いてし雌雄の判別を行った。PL15（雌雄2個体ずつ，４サンプル）とPL12（雌雄3個体ずつ，６サンプル）について，外注にて次世代シーケンスによるRNA-seq（トランスクリプーム）解析を行った。PL15について得られたreadデータを確認し，トリミング後，ゲノムアセンブルによりリファレンスを作成し，readデータのマッピングを行った。その後，雌雄サンプル間のデータを比較し，雄だけに発現するもの，雌だけに発現するもの，雌と差があり雄の発現が有意に高いもの，雄と差があり雌の発現が有意に高いものの４パターンに分けて抽出後，blast解析を行った。PL12についても同様に解析を行っている。
さらにPLの初期段階やそれ以前ステージの幼生サンプルでは，RNA-seq解析のためのRNA量が足りなかったため，新たに家系を作成し，RNAおよびDNAを抽出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍で分担研究機関(東京海洋大学)で実験，解析が実施しにくい期間があり，またDNAで複数家系を使用した詳細な解析を行ったため，RNA-seq（外注）の実施ができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本課題で得られた性連鎖SNPマーカーを用いて，さらにステージが初期段階の幼生についてDNAによる雌雄判別を行い，RNA-seq解析を実施する。発生段階初期に雌雄差のある遺伝子をリストアップすることにより，性連鎖マーカーと連鎖する候補遺伝子の探索を行う。
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