ゲノム編集における相同組み換え増幅因子の検証

• 研究課題/領域番号: 19K06472
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分42040:実験動物学関連
• 研究機関: 久留米大学 (2020-2021); 慶應義塾大学 (2019)
• 研究代表者: 塩澤 誠司 久留米大学, 医学部, 准教授 (10447039)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: ゲノム編集 / 相同組み換え / 発生工学

研究開始時の研究の概要

我々は小型霊長類であるコモンマーモセットの胚性幹（ES）細胞を用いた研究から、この細胞ではヒトiPS細胞などに比べ、相同組み換えの効率が極めて高いことを見出した。さらに、トランスクリプトームデータの解析から、ヒトES/iPS細胞と比較し、複数の相同組み換え関連遺伝子の発現が高いことを見出した。これらの遺伝子をヒトiPS細胞に強制発現させたところ、相同組み換え効率の有意な上昇を認めた。本申請研究では、この効果をさらに実証するため、マウスES細胞及びマウス受精卵におけるこれらの遺伝子の有効性を検証することを目的とする。

研究成果の概要

ゲノム編集技術において、遺伝子の欠失を目的とした単純ノックアウトと比較して、任意の変異や遺伝子断片を導入しうるノックインは未だ効率が低く、問題となる。本研究課題ではまず、マウスES細胞及びマウス受精卵において、ゲノム編集の際に簡便にノックイン効率を評価しうる系を確立した。この系を用い、強制発現によりマウスES細胞においてノックイン効率の向上が認められる遺伝子及び遺伝子セットを見出した。さらに、マウス受精卵においてはノックイン効率を上昇させる低分子化合物を見出すことに成功した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

ゲノム編集技術は簡便に遺伝子を改変できる優れた技術であり、生命科学研究のみならず医療や畜産分野などへの応用も期待されている。しかしながら、遺伝子改変の精度や効率の点では未だ改良の余地も多い。本研究課題では、ノックインによる遺伝子改変効率の改善を目的とし、まずその効率を簡便に評価する実験系を構築した。さらにこの実験系を用い、いくつかの遺伝子及び低分子化合物がノックイン効率を改善することを見出した。これにより、ゲノム編集技術の高度化に寄与することが期待される。また、今回確立した実験系を用いることで、さらに高い効果を持つ因子の発見に役立つことが期待される。

研究成果

• [雑誌論文] ヒト及び非ヒト霊長類多能性幹細胞におけるナイーブ型多能性状態の獲得 (2021)
  • 著者名/発表者名: 1)塩澤 誠司
  • 雑誌名: 九州実験動物雑誌 巻: 37 ページ: 3-7
• [雑誌論文] Generation and validation of a common marmoset embryonic stem cell line ActiCre-B1 that ubiquitously expresses a tamoxifen-inducible Cre-driver (2021)
  • 著者名/発表者名: Yoshimatsu Sho、Ohtsu Kanae、Sato Tsukika、Yamamoto Masafumi、Sasaki Erika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Stem Cell Research 巻: 51 ページ: 102164-102164
  • DOI: 10.1016/j.scr.2021.102164
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of a male common marmoset embryonic stem cell line DSY127-BV8VT1 carrying double reporters specific for the germ cell linage using the CRISPR-Cas9 and PiggyBac transposase systems (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshimatsu Sho、Sato Tsukika、Yamamoto Masafumi、Sasaki Erika、Nakajima Mayutaka、Nakamura Mari、Shiozawa Seiji、Noce Toshiaki、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Stem Cell Research 巻: 44 ページ: 101740-101740
  • DOI: 10.1016/j.scr.2020.101740
  • 査読あり
• [雑誌論文] Primed to Naive-Like Conversion of the Common Marmoset Embryonic Stem Cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shiozawa S*, Nakajima M, Okahara J, Kuortaki Y, Kisa F, Yoshimatsu S, Nakamura M, Koya I, Yoshimura M, Sasagawa Y, Nikaido I, Sasaki E, Okano H.
  • 雑誌名: Stem Cells Dev. 巻: 29 号: 12 ページ: 761-773
  • DOI: 10.1089/scd.2019.0259
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct Neuronal Reprogramming of Common Marmoset Fibroblasts by ASCL1, microRNA-9/9*, and microRNA-124 Overexpression (2020)
  • 著者名/発表者名: Nemoto Akisa、Kobayashi Reona、Yoshimatsu Sho、Sato Yuta、Kondo Takahiro、Yoo Andrew S.、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Cells 巻: 10 号: 1 ページ: 6-6
  • DOI: 10.3390/cells10010006
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshimatsu Sho、Nakamura Mari、Nakajima Mayutaka、Nemoto Akisa、Sato Tsukika、Sasaki Erika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 19 ページ: 30262-7
  • DOI: 10.1016/j.neures.2019.09.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Robust and efficient knock-in in embryonic stem cells and early-stage embryos of the common marmoset using the CRISPR-Cas9 system (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshimatsu Sho、Okahara Junko、Sone Takefumi、Takeda Yuta、Nakamura Mari、Sasaki Erika、Kishi Noriyuki、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 号: 1 ページ: 1528-1528
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37990-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment of induced pluripotent stem cells from common marmoset fibroblasts by RNA-based reprogramming (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakajima Mayutaka、Yoshimatsu Sho、Sato Tsukika、Nakamura Mari、Okahara Junko、Sasaki Erika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 515 号: 4 ページ: 593-599
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.05.175
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tau isoform expression and phosphorylation in marmoset brains (2019)
  • 著者名/発表者名: Sharma Govinda、Huo Anni、Kimura Taeko、Shiozawa Seiji、Kobayashi Reona、Sahara Naruhiko、Ishibashi Minaka、Ishigaki Shinsuke、Saito Taro、Ando Kanae、Murayama Shigeo、Hasegawa Masato、Sobue Gen、Okano Hideyuki、Hisanaga Shin-ichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 294 号: 30 ページ: 11433-11444
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.008415
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A versatile toolbox for knock-in gene targeting based on the Multisite Gateway technology (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshimatsu Sho、Sone Takefumi、Nakajima Mayutaka、Sato Tsukika、Okochi Ryotaro、Ishikawa Mitsuru、Nakamura Mari、Sasaki Erika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 14 号: 8 ページ: e0221164-e0221164
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0221164
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pathological Progression Induced by the Frontotemporal Dementia-Associated R406W Tau Mutation in Patient-Derived iPSCs (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Mari、Shiozawa Seiji、Tsuboi Daisuke、Amano Mutsuki、Watanabe Hirotaka、Maeda Sumihiro、Kimura Taeko、Yoshimatsu Sho、Kisa Fumihiko、Karch Celeste M.、Miyasaka Tomohiro、Takashima Akihiko、Sahara Naruhiko、Hisanaga Shin-ichi、Ikeuchi Takeshi、Kaibuchi Kozo、Okano Hideyuki
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 13 号: 4 ページ: 684-699
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2019.08.011
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Developing a 3D hiPSC-derived culture model system for inducing endogenous tau aggregation (2021)
  • 著者名/発表者名: Sumihiro Maeda, Hayato Hiramine, Mitsuru Ishikawa, Ikuko Koya, Ryosuke Nagashima, Seiji Shiozawa, Mari Nakamura Manabu Itoh, Hideyuki Okano
  • 学会等名: International Society for Stem Cell Research 19th annual meeting
  • 国際学会
• [学会発表] hiPSC3D培養モデルを用いた内在性タウタンパク質凝集誘導系の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 平峯勇人、前田純宏、石川充、古家育子、永島崚甫、塩澤誠司、中村真理、伊藤学、岡野栄之
  • 学会等名: 第40回日本認知症学会学術集会
• [学会発表] hiPSC3D培養モデルを用いた内在性タウタンパク質凝集誘導系の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: Hayato Hiramine, Sumihiro Maeda, Mitsuru Ishikawa, Ikuko Koya, Ryosuke Nagashima, Seiji Shiozawa, Mari Nakamura, Manabu Itoh, Hideyuki Okano
  • 学会等名: 第64回日本神経化学会大会
• [学会発表] IN VITRO DISEASE MODELING OF THE FTDP-17 TAU R406W MUTATION USING PATIENT-DERIVED IPSCS (2019)
  • 著者名/発表者名: Mari Nakamura, Seiji Shiozawa, Daisuke Tsuboi, Mutsuki Amano, Hirotaka Watanabe, Sumihiro Maeda, Taeko Kimura, Sho Yoshimatsu, Fumihiko Kisa, Celeste Karch, Tomohiro Miyasaka, Akihiko Takashima, Naruhiko Sahara, Shinichi Hisanaga, Takeshi Ikeuchi, Kozo Kaibuchi, Hideyuki Okano
  • 学会等名: International Society for Stem Cell Research 17th annual meeting
  • 国際学会
• [備考] 久留米大学医学部動物実験センター
  • URL: https://animal.med-kurume.jp/