電気生理学と分光学の統合によるイノシトールリン脂質ホスファターゼの動作原理の解析

• 研究課題/領域番号: 19K06585
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分43040:生物物理学関連
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 川鍋 陽 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2019年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: 電位依存性ホスファターゼ / 電位依存性 / 脂質代謝酵素 / 電気生理学 / イオンチャネル / 蛍光変化解析 / パッチクランプ / 膜電位センサー / 電位依存性タンパク質 / 非天然蛍光アミノ酸 / Patch Clamp Fluorometry / イノシトールリン脂質 / 脱リン酸化酵素 / 電位センサー / ホスファターゼ / 電位依存性イオンチャネル

研究開始時の研究の概要

細胞内シグナル伝達に重要な酵素群であるイノシトールリン脂質ホスファターゼ[PIPase: イノシトールリン脂質を脱リン酸化する酵素] が基質をどのように認識するのか・酵素活性をON/OFFにするのかなどの分子作用機序は不明であった。そこで本研究では、電位によって活性のON/OFFを制御可能な電位依存性ホスファターゼVSPを用いることで、酵素活性がONになる際の構造変化および、膜との距離変動を蛍光プローブを用いることで評価し、PIPaseに共通する動作原理を解明することを目的にしている。

研究成果の概要

イノシトールリン脂質ホスファターゼ [PIPase: PI(4,5)P2などを脱リン酸化する酵素] は生理的に重要な機能を担っている。本研究では、電位依存性ホスファターゼ (VSP, PIPaseの一種) の酵素活性機構を明らかにし、PIPaseに共通する動作原理を解明することを目指した。そのために、非天然蛍光アミノ酸Anapを導入したVSPの蛍光変化から局所的な構造変化情報を取得し、VSPの活性化時に「電位センサー」と「酵素領域」の疎水性部位の相対的な距離が変動することにより、酵素活性に影響を与えていることが示唆された。また、これらの成果を基に機能向上型VSPを作製した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

細胞膜構成成分の1つであるイノシトールリン脂質 (PI) は、細胞膜上でシグナル伝達の役割も担い、生体の恒常性を維持するために重要である。PIの生理的機能を調整する酵素の1つがイノシトールリン脂質ホスファターゼ (PIPase) であるが分子機能の動作原理まで踏みんだ研究は進んでいない。その中で、われわれは機能解析と構造変化解析を組み合わせることで、動作機構を解明した。得られた知見は、PIPaseをターゲットとする臨床医学・創薬研究の基盤となると考えている。また、新規に作製した機能向上型VSPは、分子ツールとしてのさらなる活用が見込まれるため、研究分野の発展にも貢献できている。

研究成果

• [国際共同研究] Weizmann Institute of Science/The Hebrew University of Jerusalem/Israel Institute of Technology(イスラエル)
• [国際共同研究] Humboldt-Universit zu Berlin(ドイツ)
• [雑誌論文] Rhodopsin-bestrophin fusion proteins from unicellular algae form gigantic pentameric ion channels (2022)
  • 著者名/発表者名: Rozenberg A,Kaczmarczyk I,Matzov D,Vierock J,Nagata T,Sugiura M,Katayama K,Kawasaki Y,Konno M,Nagasaka Y,Aoyama M,Das I,Pahima E,Church J,Adam S,Borin VA,Chazan A,Augustin S,Wietek J,Dine J,Peleg Y,Kawanabe A,Fujiwara Y,Yizhar O,Sheves M,Schapiro I,Furutani Y,Kandori H,Inoue K,Hegemann P,Beja O,Shalev-Benami M.
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 29 号: 6 ページ: 592-603
  • DOI: 10.1038/s41594-022-00783-x
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Interaction between S4 and the phosphatase domain mediates electrochemical coupling in voltage-sensing phosphatase (VSP) (2022)
  • 著者名/発表者名: Mizutani Natsuki、Kawanabe Akira、Jinno Yuka、Narita Hirotaka、Yonezawa Tomoko、Nakagawa Atsushi、Okamura Yasushi
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 号: 26
  • DOI: 10.1073/pnas.2200364119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intermolecular functional coupling between phosphoinositides and the potassium channel KcsA (2022)
  • 著者名/発表者名: Kiya Takunari、Takeshita Kohei、Kawanabe Akira、Fujiwara Yuichiro
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 298 号: 8 ページ: 102257-102257
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102257
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Heterologous functional expression of ascidian Nav1 channels and close relationship with the evolutionary ancestor of vertebrate Nav channels (2021)
  • 著者名/発表者名: Kawai Takafumi、Hashimoto Masaki、Eguchi Natsuki、Nishino Junko M.、Jinno Yuka、Mori-Kreiner Risa、Aspaker Mans、Chiba Daijiro、Ohtsuka Yukio、Kawanabe Akira、Nishino Atsuo S.、Okamura Yasushi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 296 ページ: 100783-100783
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100783
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Engineering an enhanced voltage-sensing phosphatase (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawanabe Akira、Mizutani Natsuki、Polat Onur K.、Yonezawa Tomoko、Kawai Takafumi、Mori Masayuki X.、Okamura Yasushi
  • 雑誌名: Journal of General Physiology 巻: 152 号: 5
  • DOI: 10.1085/jgp.201912491
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The mechanoreceptor DEG-1 regulates cold tolerance in Caenorhabditis elegans (2020)
  • 著者名/発表者名: Takagaki N., Ohta A., Ohnishi K., Kawanabe A., Minakuchi Y., Toyoda A., Fujiwara Y., Kuhara A.
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 21 号: 3 ページ: 1-14
  • DOI: 10.15252/embr.201948671
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Functional analysis of a double-point mutation in the KCNJ2 gene identified in a family with Andersen-Tawil syndrome (2019)
  • 著者名/発表者名: Fukumura Shinobu、Yamauchi Kosuke、Kawanabe Akira、Yamamoto Akiyo、Nakaza Maki、Kubota Tomoya、Kato Shinsuke、Sasaki Ryogen、Okamura Yasushi、Takahashi Masanori P.
  • 雑誌名: Journal of the Neurological Sciences 巻: 407 ページ: 116521-116521
  • DOI: 10.1016/j.jns.2019.116521
  • 査読あり
• [学会発表] Mechanisms of voltage-depndent H+ channel activity regulated by membrane stretch and lipids (2023)
  • 著者名/発表者名: Takata Maki, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] Functional regulation of phosphoinositides to the potassium channel KcsA (2023)
  • 著者名/発表者名: Takunari Kiya, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: カリウムチャネルKcsAに対するイノシトールリン脂質の機能制御
• [学会発表] Direct interaction between the voltage-gated proton channel and ATP (2023)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Maki Takata, Kohei Takeshita and Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] ATPは電位依存性プロトンチャネルHv1に直接結合して活性を制御する (2022)
  • 著者名/発表者名: 川鍋陽、竹下浩平、高田麻紀、藤原祐一郎
  • 学会等名: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [学会発表] カリウムチャネルKcsAとイノシトールリン脂質の分子間相互作用と機能修飾 (2022)
  • 著者名/発表者名: 紀谷拓音、竹下浩平、川鍋陽、藤原祐一郎
  • 学会等名: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [学会発表] Intracellular ATP controls the voltage-gated proton channel (2022)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Maki Takata and Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会
• [学会発表] Toward an analysis of the effects of hydrogen sulfide on the voltage-gated potassium channel (2022)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe and Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 4th International Conference on Persulfide and Sulfur Metabolism in Biology and Medicine
  • 国際学会
• [学会発表] The voltage-gated proton channel is regulated by ATP (2022)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Maki Takata and Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第99回日本生理学会大会
• [学会発表] カリウムチャネルとイノシトールリン脂質の分子間相互作用と機能修飾 (2022)
  • 著者名/発表者名: 紀谷拓音、竹下浩平、川鍋陽、藤原祐一郎
  • 学会等名: 2021（令和3）年度 生理研研究会 細胞の局所コミュニティ研究会
• [学会発表] 膜タンパク質の分子機構解析への 非天然蛍光アミノ酸の活用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川鍋陽、坂田宗平、岡村康司
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
  • 招待講演
• [学会発表] Cytoplasmic structural changes of voltage-sensing phosphatase detected by patch clamp fluorometry. (2021)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第98回日本生理学会大会
• [学会発表] 電位依存性プロトンチャネル活性に影響する細胞内分子 (2020)
  • 著者名/発表者名: 川鍋陽、藤原祐一郎
  • 学会等名: 生理学研究所研究会
• [学会発表] Intracellular regulation of the voltage-gated proton channel. (2020)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第58回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 非天然蛍光アミノ酸を用いた膜タンパク質の動作メカニズム解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 川鍋陽、米澤智子、神野有香、坂田宗平、岡村康司
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
  • 招待講演
• [学会発表] The conformational change of the cytoplasmic region of voltage-sensing phosphatase (2020)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Manami Nishizawa, Kazuhisa Nishizawa, Hirotaka Narita, Tomoko Yonezawa, Yuka Jinno, Souhei Sakata, Atsushi Nakagawa, Yasushi Okamura
  • 学会等名: 第97回日本生理学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] Improvement of voltage-sensing phosphatase as a molecular tool of phosphoinositide depletion in living cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Akira Kawanabe, Natuki Mizutani, Tomoko Yonezawa, Yasushi Okamura
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
• [備考] 香川大学医学部 分子生理学講座
  • URL: https://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [備考] 香川大学医学部分子生理学講座Webページ
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [備考] 香川大学医学部分子生理学講座
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [備考] 香川大学医学部 分子生理学講座
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html