| 研究課題/領域番号 |
19K06941
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分46030:神経機能学関連
|
|---|
| 研究機関 | 宮崎大学 |
|---|
研究代表者 |
若園 佳彦 宮崎大学, 医学部, 准教授 (90377755)
|
|---|
| 研究分担者 |
緑川 良介 宮崎大学, 医学部, 助教 (20470320)
高宮 考悟 宮崎大学, 医学部, 教授 (40283767)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2020年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2019年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
|
|---|
| キーワード | AMPA受容体 / N型糖鎖修飾 / 細胞膜への移行 / 全反射蛍光顕微鏡法 / 一分子動態観察 / 全反射蛍光顕微鏡 / 糖鎖修飾 / 一分子イメージング |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
糖鎖に関する研究は、その多様性に加え、機能解析があまりにも煩雑であるため、腫瘍マーカーへの利用などを除き、体系的な研究はほとんどなされていない。
最近、我々の研究室では、AMPA型グルタミン酸受容体のサブユニットの一つであるGluA1の糖鎖修飾が細胞膜への発現制御に関与することを報告したが、詳細なメカニズムについては未だ不明である。
そこで本研究では、受容体分子の合成から分解までの素過程を一分子動態解析により解明することを目指す。
本研究は、神経細胞における機能分子の発現制御という糖鎖の新たな役割の一端を拓くものと考える。
|
| 研究実績の概要 |
本研究は、AMPA型グルタミン酸受容体（AMPA受容体）の糖鎖修飾が、如何にしてAMPA受容体の細胞膜への発現（移行）を制御しているのかを明らかにすることを目的としており、そのための手法として受容体分子の詳細な動態解析が可能な全反射蛍光顕微鏡（TIRF）法を用いる。
研究実施計画は３つのステップからなり、前年度までに、①観察（TIRF）システムの構築についてはほぼ完了し、②糖鎖修飾を欠損させた変異型GluA1（N63Q、N363Q）に蛍光標識した発現ベクターの作製については、変異型GluA1のベースとなる野生型GluA1に蛍光タグ、EGFP（緑色蛍光タンパク質）を付けた発現ベクターを作製し、HEK293細胞への強制発現後、蛍光顕微鏡下においてGluA1-EGFPの蛍光シグナルを確認した。
今年度においては、前年度に作製した野生型GluA1の発現ベクターが機能を保持しているか否かについて、電気生理学的手法を用いて確認を試みた。具体的には、この発現ベクタ－を用いてHEK293細胞へ強制発現させた後、EGFPの蛍光シグナルを持つHEK293細胞に対してホールセルパッチクランプ法を適用し、グルタミン酸に対する応答性を確認した。また、並行して野生型GluA1の発現ベクターをベースにEGFPで標識された変異型GluA1（N63Q、N363Q）の発現ベクターも作製した。さらに構築した観察システム（顕微鏡ステージ）に合わせたチャンバーの作製も行った。このチャンバーには灌流システムが付属しており、常時、細胞外溶液を灌流することにより、数時間、生きた細胞を観察することが可能となる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
既述のとおり、研究計画では、①観察システムの構築、②発現ベクターの作製、③実際の観察によるデータの取得に大別され、現時点では、①②はほぼ完了しており、残りの計画を完遂するには、さらに半年から1年を要するものと考える。従って、研究期間の延長を申請し、受理されている。
研究計画の遅延の最大の理由は、新型コロナの蔓延に伴い研究以外の他の業務において、その対応に追われることになり、結果として研究活動に十分な時間を割くことが出来なかった。さらに学術学会の中止や規模の縮小は、予備実験の結果などの成果発表や意見交換などの貴重な場を失うこととなり、サプライチェーンの停滞なども含めて、円滑な研究活動を十分に行うことが出来なかった。今年度前半は、特にこのような状況に見舞われた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策としては、作製したEGFPで標識された変異型GluA1（N63Q、N363Q）の発現ベクターについて、以前に我々の研究室が報告した生化学及び電気生理学的手法による解析と一致して、細胞膜での発現やグルタミン酸に対する応答性が消失していることを確認する。そしてこれらの確認を終えた後、①で構築したTIRF観察システムを用いて、野生型及び変異型GluA1の分子動態観察を行い比較検討する。TIRF法による蛍光像は、エバネッセント光の沁み出し厚により観察領域の深度が大きく変わり、そしてその染み出し厚は励起光の入射角に依存することが知られている。染み出し厚はAxelrodの式により概算可能であることから、励起光の入射角を調整しつつ、得られる蛍光像を比較検討する。つまり、観察領域を細胞膜近傍のみから細胞質内至る領域まで変えることにより、変異型GluA1（N63Q、N363Q）の発現分布を明らかにする。
TIRF法による細胞内の観察が困難な場合は、薄層斜光照明法を試みる。
|
