| 研究課題/領域番号 |
19K09836
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56040:産婦人科学関連
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
藤岡 仁美 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (50410064)
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| 研究分担者 |
萩原 裕子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (90468207)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2020年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2019年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | GnRH / ミクログリア / ストレス / Kisspeptin / 機能性視床下部生性腺機能低下 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
機能性視床下部性性腺機能低下はストレスと関連があることが知られている。また、ストレスにより脳内で炎症反応が起こることも報告されている。本研究は、脳の免疫担当細胞であるミクログリアの活性化が、視床下部レベルで生殖機能を抑制するのかを検討することを目的とする。本研究は、脳内炎症によるLH分泌抑制機序を明らかにするものであり、ミクログリア活性化をターゲットとした治療法や創薬への貢献が期待される。
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| 研究実績の概要 |
本年度は、昨年度に引き続き問題となっているミクログリアへの低遺伝子導入効率を改善するため、Linら(2022, Nat Methods 19, 976-985)がマウスのミクログリアへの高率の遺伝子導入を報告したセロタイプであるAAV.MG1.2をもちいてラットミクログリアへの遺伝子導入を検討した。
AAV.MG1.2-SFFV-mCherry-DIO-DTAをLE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラット（ミクログリア/Mφ系細胞でタモキシフェン誘導によりCreリコンビナーゼが活性化する組換え遺伝子をラット）の線状体に1.5 uL投与した。タモキシフェン非存在下で飼育し３週間後にサンプリングを行い、ミクログリアのマーカータンパク質であるIba1に対する抗体で免疫染色を行い、Iba1陽性細胞におけるmCherry発現を検討した。しかし、Iba1陽性細胞でも陰性細胞でもmCherryの発現は認められなかった。
原因として、SFFVプロモーター活性が低い可能性、何らかの理由でDTAの発現が生じておりミクログリアが死滅し、新たなミクログリアと置き換わっている可能性などが考えられ、これを検討するため、プロモーターをCMVプロモーターに変更し、mCherry-DIO-DTAをGFPに変更したAAV.MG1.2-CMV-GFPウイルスベクターを現在制作中である。ベクターができ次第、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットに投与し、ミクログリアへの遺伝子導入を検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和５年度は令和４年度に引き続き、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットを用いて、ミクログリアを操作する実験に着手する目的で、ミクログリアに効率に遺伝子導入できるセロタイプを選定するため、AAVベクターの投与実験を重ねたが、いまだミクログリアで導入遺伝子を発現させるに至っておらず、研究の進捗は遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和６年度は、プロモーターをCMVプロモーターに変更し、mCherry-DIO-DTAをGFPに変更したAAV.MG1.2-CMV-GFPウイルスベクターを作成し、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットに投与して、ミクログリアへの遺伝子導入を検討する。また、AAV.MG1.2セロタイプが、ラットのミクログリアに対しては遺伝子導入効率が悪い可能性もあるため、Okadaら(2022, Commun Biol 5, 1224)がマウスのミクログリアへの高率の遺伝子導入を報告しているAAV9セロタイプを用いてミクログリアへの遺伝子導入を検討する予定である。ミクログリアへの遺伝子導入の条件が決定次第、速やかにミクログリアを特異的に除去する実験を、続いてDREADDによるミクログリア活性化を抑制する実験の検討を行う予定である。
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