プラスミドの接合伝達装置の祖先型構築と接合伝達阻害・促進化合物の同定

• 研究課題/領域番号: 19K15725
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分38020:応用微生物学関連
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 岸田 康平 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (80816843)
• 研究期間 (年度): 2021-11-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2021年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2019年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: プラスミド / 接合伝達 / 遺伝子の水平伝播 / 水平伝播 / T4SS

研究開始時の研究の概要

プラスミドの接合伝達は細菌の遺伝子水平伝播の主役であり、人類にとって有害あるいは有益な細菌の出現に深く関わる。本研究では、接合伝達を阻害または促進する化合物を同定し、有害細菌の出現抑制や有益細菌の効率的育種を可能にすることを目的とした。現存する接合伝達装置の共通性質を有す祖先型接合伝達装置を構築してその阻害・促進化合物を同定する。本化合物は実在する多くの接合伝達装置に作用すると考えられるが、実際に有害細菌の出現抑制と有益細菌の効率的育種へ寄与するかを検討し、接合伝達阻害・促進化合物の有効性を提示する。

研究実績の概要

抗生物質耐性菌の出現は世界規模で深刻な社会問題になっている。一方で、抗生物質耐性菌の出現にはプラスミドの接合伝達が関与していることが明らかとなっている。接合伝達を阻害する化合物はいくつか同定されているが、多様性に富むプラスミドの接合伝達装置のうち一部のプラスミドの接合伝達しか阻害できていない。本研究では、（1）祖先型の接合伝達装置の構築、（2）大規模な化合物ライブラリから本接合伝達装置を阻害する化合物の同定（3）実環境に近い環境下でのその化合物の機能評価を行う。
本年度では、接合伝達の阻害に焦点を当て、以下の成果を得た。（1）プラスミドの接合伝達は、ATPase（VirB11ホモログ)によってエネルギーを獲得し、駆動していると考えられている。よって、VirB11ホモログは接合伝達阻害物質のターゲットとして主な候補タンパク質である。多様性に富む接合伝達装置のうち、最も研究がよく進んでいるMPF_T型のプラスミドの祖先型の構築に向けて、FireProt-ASRを用いて数百のプラスミド由来のVirB11ホモログから祖先型のVirB11ホモログの推定を行った。本ホモログの配列を解析すると、ATPaseとして重要なアミノ酸残基を有していた。（2）昨今、ペプチドを用いた創薬技術が発展しているが、本研究でも本技術を取り入れ、接合伝達関連タンパク質と結合することで接合伝達を阻害するペプチドを推定した。細胞質に局在する4つの接合伝達関連タンパク質を候補として、8つのペプチドを推定した。8つのペプチドは水素結合や疎水結合などを介してターゲットとなるタンパク質と結合していると推定された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

海外への渡航によって本研究を4年程度留保していた。着任の時期の都合上、本研究を実施したのは1か月程度であったので、進展がやや遅れている。一方で、本研究の最重要項目のひとつである祖先型のATPaseのアミノ酸配列の推定を実施することができた。また、新たな着想として阻害ペプチドを用いた接合伝達阻害というアプローチを見出し、実施することができた。

今後の研究の推進方策

1．祖先型ATPaseに関する研究：(a)祖先型ATPaseを発現するプラスミドの全遺伝子合成を行い、本ATPaseの精製を行い、実際にATPase活性を有しているかを検討する.(b)祖先型構築に用いたプラスミドの接合伝達装置内で、本ATPaseが現存のATPaseの機能を相補可能かを検討する（c）化合物ライブラリを用いて、ATPase活性を阻害する物質の同定を試みる。
2．阻害ペプチドに関する研究：(a)阻害ペプチドを発現するプラスミドの全遺伝子合成を行い、本プラスミドによって接合伝達の阻害が起きるかどうかを接合伝達頻度で評価する。（b）阻害ペプチドが実際にターゲットとした接合伝達関連タンパク質に結合するかどうかをプルダウンアッセイやBacterial two-hybrid法を用いて検討する。（c）細胞膜透過シグナルを付与した阻害ペプチドを合成し、細胞に添加することで阻害が起きるかどうかを検討する。
3．実環境に近い環境下での研究：（a)本研究室で長らく用いている土壌マイクロコズムを用いて研究1と研究2で得られた阻害化合物と阻害ペプチドが実際に機能するかどうかを検討する。
一方で、接合伝達の促進化合物の同定も本研究の目的の1つである。本促進化合物は、研究1で行う化合物ライブラリを用いた解析の中から得られると期待される。