ゲノム編集技術を用いた糖尿病性腎症発症モデルブタの創出

• 研究課題/領域番号: 19K16014
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分42030:動物生命科学関連
• 研究機関: 自治医科大学 (2020); 徳島大学 (2019)
• 研究代表者: 谷原 史倫 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90754680)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2020年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円); 2019年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: ブタ / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / エレクトロポレーション / 体外受精 / 糖尿病性腎症 / モデルブタ

研究開始時の研究の概要

本研究では、医学領域における糖尿病性腎症の発症メカニズムの解明および前臨床試験研究に使用する糖尿病性腎症モデルブタの作製を行う。
具体的にはこれまでに作製した膵臓形成に関連するPDX1遺伝子改変糖尿病ブタの精子を用いて体外受精卵を作製し、さらにゲノム編集技術を用いて生体の血圧調整に関連するBK2R遺伝子をノックアウトすることで、BK2R遺伝子とPDX1遺伝子を改変し、糖尿病と高血圧の両疾患を有する糖尿病性腎症発症モデルブタを創出する。糖尿病患者は高血圧も同時に患うケースが多く、よりヒトの病態に近いモデル動物として外挿性の高い効果的な研究が可能となると期待できる。

研究成果の概要

本研究では、PDX1改変糖尿病ブタの精子を用いて作製した体外受精卵へのBDKRB2遺伝子を標的としたゲノム編集により糖尿病性腎症モデルブタの作出を目指した。BDKRB2遺伝子を高効率に改変するgRNA2種の同定を行い、それらを用いてゲノム編集胚を作出後に受胚ブタに移植したが産子を得ることはできなかった。一方、PDX1ヘテロノックアウトブタを作出し糖尿病に関連する表現型の観察を行ったところ、野生型ブタと比較し健康上の異常は認められず、耐糖試験の結果でも差は認められなかった。ブタでは、PDX1遺伝子単独のヘテロノックアウトでは糖尿病を誘発するには不十分であることが示唆された。

研究成果の学術的意義や社会的意義

糖尿病患者は増加の一途を辿り、同時に問題となる糖尿病性腎症も含めてその病態解明および治療法の開発研究のため疾患モデルブタの担う役割は大きい。本研究では目的とする遺伝子改変ブタを得ることはできなかったが、本研究結果からPDX1遺伝子単独のヘテロノックアウトではブタでは糖尿病を誘発するには不十分であることが示唆された。PDX1遺伝子ヘテロノックアウトマウスでは膵臓β細胞からのインスリン分泌が低下することが知られているが、ブタでは表現型が異なることが示唆された。今後、糖尿病モデルブタの作出を目指す上で重要な知見が得られた。

研究成果

• [雑誌論文] One-Step Generation of Multiple Gene-Edited Pigs by Electroporation of the CRISPR/Cas9 System into Zygotes to Reduce Xenoantigen Biosynthesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanihara F., Hirata M., Nguyen TN., Sawamoto O., Kikuchi T., Otoi T.
  • 雑誌名: International journal of molecular sciences 巻: 22 号: 5 ページ: 2249-2249
  • DOI: 10.3390/ijms22052249
  • NAID: 120007164926
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lipofection-Mediated Introduction of CRISPR/Cas9 System into Porcine Oocytes and Embryos (2021)
  • 著者名/発表者名: Hirata M., Wittayarat M., Namula Z., Le AQ., Lin Q., Takebayashi K., Thongkittidilok C., Tanihara F., Otoi T.
  • 雑誌名: Animals 巻: 11 号: 2 ページ: 578-578
  • DOI: 10.3390/ani11020578
  • NAID: 120007147677
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of the effects of introducing the CRISPR/Cas9 system by microinjection and electroporation into porcine embryos at different stages (2021)
  • 著者名/発表者名: Le AQ., Tanihara F., Wittayarat M., Namula Z., Sato Y., Lin Q., Takebayashi K., Hirata M., Otoi T.
  • 雑誌名: BMC Research Notes 巻: 14 号: 1 ページ: 7-7
  • DOI: 10.1186/s13104-020-05412-8
  • NAID: 120007147670
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Introduction of a point mutation in the KRAS gene of in vitro fertilized porcine zygotes via electroporation of the CRISPR/Cas9 system with single-stranded oligodeoxynucleotides. (2021)
  • 著者名/発表者名: Wittayarat M., Hirata M., Namula Z., Sato Y., Nguyen TN., Le AQ., Lin Q., Takebayashi K., Tanihara F., Otoi T.
  • 雑誌名: Animal Science Journal, 巻: 92 号: 1
  • DOI: 10.1111/asj.13534
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] One-step genome editing of porcine zygotes through the electroporation of a CRISPR/Cas9 system with two guide RNAs (2020)
  • 著者名/発表者名: Hirata M., Wittayarat M., Tanihara F., Sato Y., Namula Z., Le AQ., Lin Q., Takebayashi K., Otoi T.
  • 雑誌名: In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 巻: 56 号: 8 ページ: 614-621
  • DOI: 10.1007/s11626-020-00507-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes (2020)
  • 著者名/発表者名: Tanihara F., Hirata M., Nguyen TN., Sawamoto O., Kikuchi T., Masako Doi., Otoi T.
  • 雑誌名: BMC biotechnology 巻: 20 号: 1 ページ: 40-40
  • DOI: 10.1186/s12896-020-00638-7
  • NAID: 120007045051
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Evaluation of multiple gene targeting in porcine embryos by the CRISPR/Cas9 system using electroporation (2020)
  • 著者名/発表者名: Hirata M., Wittayarat M., Namula Z., Le AQ., Lin Q., Nguyen TN., Takebayashi K., Sato Y., Tanihara F., Otoi T.
  • 雑誌名: Molecular Biology Reports 巻: 47 号: 7 ページ: 5073-5079
  • DOI: 10.1007/s11033-020-05576-3
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of viable PDX1 gene‐edited founder pigs as providers of nonmosaics (2020)
  • 著者名/発表者名: Tanihara F, Hirata M, Thi Nguyen N, Anh Le Q, Hirano T, Otoi T.
  • 雑誌名: Mol Reprod Dev 巻: - 号: 4 ページ: 471-481
  • DOI: 10.1002/mrd.23335
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes (2020)
  • 著者名/発表者名: Tanihara, F., Hirata, M., Nguyen, TN., Le, AQ., Wittayarat, M., Fahrudin, M., Hirano, T., Otoi, T.
  • 雑誌名: Animal Biotechnology 巻: - 号: 2 ページ: 147-154
  • DOI: 10.1080/10495398.2019.1668801
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] エレクトロポレーションを用いたCRISPR/Cas9システムのブタ体外受精卵への導入によるCD163遺伝子改変ブタの作製 (2019)
  • 著者名/発表者名: 谷原史倫、平田真樹、Nhien Thi Nguyen、Quynh Anh Le、平野隆之、音井威重
  • 学会等名: 第162回日本獣医学会学術集会