試験管内アッセイ系による大腸菌外膜タンパク質膜組込み装置の分子機構の解明

• 研究課題/領域番号: 19K16077
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分43030:機能生物化学関連
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 塩田 拓也 宮崎大学, キャリアマネジメント推進機構, 准教授 (20819304)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2020年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2019年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
• キーワード: BAM複合体 / グラム陰性菌 / βバレル型膜タンパク質 / ミトコンドリア / トランスロケータ / βバレル / タンパク質輸送 / バクテリア外膜 / ミトコンドリア外膜 / 膜タンパク質 / 大腸菌 / 外膜タンパク質

研究開始時の研究の概要

グラム陰性菌は、内膜外膜の２枚の生体膜をもち、外膜にはβバレル型膜タンパク質が存在する。これらは物質透過等の生育、毒素分泌等の攻撃、抗生物質除去等の防御と様々な役割をもつ。βバレル型膜タンパク質が機能を発揮するためには、正しい立体構造を伴った外膜組込みが必須であり、この過程は、外膜に存在するBAM複合体とよばれるタンパク質複合体によって行われる。BAM複合体はその立体構造が解かれているが、その分子機構は明らかになっていない。本研究では、大腸菌をモデル生物とし、独自に開発した生化学的手法を駆使してその分子機構の解明を目指す。

研究成果の概要

グラム陰性菌の外膜に存在するβバレル型膜タンパク質は、生育や感染など様々な役割を担っている。これらが機能するためには、正しい立体構造を伴った膜組込み（アセンブリー）が必須である。アセンブリーは外膜に存在するBAM複合体によって行われる。本研究では、独自の試験管内アッセイ法によって、基質に存在するBAM複合体に認識される特徴的な配列を見つけた。さらに、中性子反射率法によって基質やサブユニットの結合に伴って引き起こされるBAM複合体の構造変化を検出することに成功した。また、ミトコンドリアのβバレル型膜タンパク質の輸送に関わる装置の立体構造および、輸送に関わる連携機構を解明した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

タンパク質の輸送に関わる分子機械を動的に解析することは技術的な挑戦を伴う。本研究では、試験管内アッセイ法と中性子反射率法という2つの手法を駆使し、その動的な分子機構の一端を解明した。
グラム陰性菌はWHOが指定する喫緊に対策が必要な薬剤耐性菌の75%を占める。アセンブリーはグラム陰性菌の生育に必須の生理現象であり、事実アセンブリー装置を標的とした抗生物質が近年報告されている。本研究では、アセンブリーの中核を担うBAM複合体について、分子機構の解明に大きく貢献しうる構造変化を解明した。さらに、基質に存在するシグナルを発見した。これらは、今後の分子標的薬の設計を容易にすることが期待できる。

研究成果

• [国際共同研究] モナッシュ大学(オーストラリア)
• [国際共同研究] モナシュ大学(オーストラリア)
• [雑誌論文] Substrate-dependent arrangements of the subunits of the BAM complex determined by neutron reflectometry (2021)
  • 著者名/発表者名: Chen Xiaoyu、Ding Yue、Bamert Rebecca S.、Le Brun Anton P.、Duff Anthony P.、Wu Chun-Ming、Hsu Hsien-Yi、Shiota Takuya、Lithgow Trevor、Shen Hsin-Hui
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 巻: in press 号: 9 ページ: 183587-183587
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2021.183587
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Characterization of BamA reconstituted into a solid-supported lipid bilayer as a platform for measuring dynamics during substrate protein assembly into the membrane (2020)
  • 著者名/発表者名: Ding Yue、Shiota Takuya、Le Brun Anton P.、Dunstan Rhys A.、Wang Bo、Hsu Hsien-Yi、Lithgow Trevor、Shen Hsin-Hui
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 巻: 1862 号: 9 ページ: 183317-183317
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2020.183317
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of mitochondrial import gate reveals distinct preprotein paths. (2019)
  • 著者名/発表者名: Araiso, Y., Tsutsumi, A., Qui, J., Imai, K., Shiota, T., Song, J., Lindau, C., Wenz, LS., Sakaue,H., Yunoki, K., Kawano, S., Suzuki, J., Wichnewski, M., Schutze, C., Ariyama, H., Ando, T., Becker, T., Lithgow, T., Weidemann, N., Pfanner, N., Kikkawa, M., Endo, T.
  • 雑誌名: Nature 巻: 575 号: 7782 ページ: 395-401
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1680-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 大腸菌のその瞬間の外膜タンパク質の輸送をin vitroで再現する、EMMアセンブリーアッセイ。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 塩田 拓也
  • 学会等名: ゲノム微生物学会
  • 招待講演
• [学会発表] バクテリア外膜タンパク質アセンブリー解析の新手法「EMMアセンブリーアッセイ」 (2020)
  • 著者名/発表者名: 塩田拓也
  • 学会等名: 第93回日本細菌学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 大腸菌外膜βバレル型膜タンパク質輸送阻害ペプチドの探索 (2019)
  • 著者名/発表者名: 塩田拓也
  • 学会等名: 第16回21世紀大腸菌研究会
• [学会発表] Two major technical improvement unlocked the secret of mitochondrial protein entry gate. (2019)
  • 著者名/発表者名: 塩田拓也
  • 学会等名: Osaka Mito 2019
  • 招待講演