生体膜での脂肪酸ナノスケール解析技術確立による不飽和脂肪酸生理機能発現機序の解明

• 研究課題/領域番号: 19K22435
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分44:細胞レベルから個体レベルの生物学およびその関連分野
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
• 研究分担者: 正谷 達謄 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (70614072)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円); 2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円); 2019年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
• キーワード: 電子顕微鏡 / クリックケミストリー / 脂肪酸 / 微細局在 / 脂質二重層 / 脂質 / ナノスケール / 急速凍結 / フリーズフラクチャー / 微細構造 / 生体膜 / 微細分布 / 超微細構造 / 凍結割断レプリカ法

研究開始時の研究の概要

本研究では急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を改良することにより、逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発し、膜脂質の疎水性領域である各種脂肪酸の微細分布の解析を可能にすることを目的とする。近年、不飽和脂肪酸（UFA）の生体内での増加が発癌、癌転移、精神疾患、インスリン抵抗性の改善など種々の生理機能に関与することがわかってきた。UFAは食物による補給により作用が発揮されることもわかっているが、どのように細胞に作用して機能関与するのかなど作用機序は全く不明である。逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発することにより、世界に先駆けて、UFAがもたらす生理的作用の機序解明の基礎的情報を獲得できると確信する。

研究実績の概要

生体膜を構成する膜脂質は“頭部”の親水性部位とそれに結合する脂肪酸の “尾部”である疎水性部位により構成される。膜脂質に関しては有力な解析技術が少ないため、まだまだ未知の点が多く残されている。特に脂質二重層の内部を構成する脂肪酸に関しては細胞内でどのように分布しているのかという情報は極めて少ないのが現状である。代表者らは、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法（Quick-freezing & freeze-fracture replica labeling method: QF-FRL）をさらに改良することにより、逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに開発し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析することを試みた。HeLa細胞の細胞膜、および細胞内の構造体に蛍光標識が確認できた。対照実験として，培養液にアルキン化オレイン酸を含まないHeLa細胞では、同じ蛍光標識を行なっても、全く蛍光標識は確認できなかったため、本実験でのHeLa細胞で確認できた蛍光標識は生体膜に取り込まれたアルキン化オレイン酸であると考えられる。以上の実験より、培養液内のアルキン化脂肪酸を入れて哺乳類培養細胞を培養することにより、生体膜の脂肪酸を蛍光標識し可視化できると確認できた。一方、逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を用いて電子顕微鏡により脂肪酸の微細分布を検討する実験を行なった。エッチングを行なったレプリカ薄膜では、アルキン化オレイン酸あるいはアルキン化アラキドン酸共に、生体膜において特異的な標識を得ることはできなかった。一方、逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を用いて電子顕微鏡により脂肪酸の微細分布を検討する実験を行なった。エッチングをしなかったレプリカ薄膜では、アルキン化アラキドン酸のアルキン基を標識することに成功した。これらの結果から、生体膜に存在するアラキドン酸が親水性領域側にアルキン基、つまり脂肪酸の末端が露出していることを示唆された。

研究成果

• [国際共同研究] Harvard University(米国)
• [国際共同研究] Havard University(米国)
• [国際共同研究] Harvard University(米国)
• [雑誌論文] Coordinated regulation of phosphatidylinositol 4-phosphate and phosphatidylserine levels by Osh4p and Osh5p is an essential regulatory mechanism in autophagy (2024)
  • 著者名/発表者名: Muramoto Moe、Mineoka Nanaru、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Masatani Tatsunori、Fujita Akikazu
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 巻: 1866 号: 4 ページ: 184308-184308
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2024.184308
  • 査読あり
• [雑誌論文] Essential roles of phosphatidylinositol 4-phosphate phosphatases Sac1p and Sjl3p in yeast autophagosome formation (2022)
  • 著者名/発表者名: Muramoto Moe、Yamakuchi Yuki、Konishi Rikako、Koudatsu Shiomi、Tomikura Hiromu、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Kurokawa Yuna、Masatani Tatsunori、Tamaki Hisanori、Fujita Akikazu
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 巻: 1867 号: 9 ページ: 159184-159184
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2022.159184
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selective increment of phosphatidylserine on the autophagic body membrane in yeast’s vacuole. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamakuchi, Y., Kurokawa, Y., Konishi, R., Fukuda, K., Masatani, T., Fujita, A.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 595 号: 17 ページ: 2197-2207
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14167
  • 査読あり
• [雑誌論文] Glycosphingolipid GM3 is localized in both exoplasmic and cytoplasmic leaflets of Plasmodium falciparum malaria parasite plasma membrane (2021)
  • 著者名/発表者名: Shiomi Koudatsu, Tatsunori Masatani, Rikako Konishi, Masahito Asada, Hassan Hakimi, Yuna Kurokawa, Kanna Tomioku, Osamu Kaneko & Akikazu Fujita
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 11 号: 1 ページ: 14890-14890
  • DOI: 10.1038/s41598-021-94037-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The distribution of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the budding yeast plasma membrane. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa, Y., Konishi, R., Yoshida, A., Tomioku, K., Tanabe, K., Fujita, A.
  • 雑誌名: Histochem. Cell Biol. 巻: 156 号: 2 ページ: 109-121
  • DOI: 10.1007/s00418-021-01989-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Raft microdomain localized in the luminal leaflet of inner membrane complex of living Toxoplasma gondii (2021)
  • 著者名/発表者名: Konishi R et al.
  • 雑誌名: Eur J Cell Biol 巻: 100 号: 2 ページ: 151149-151149
  • DOI: 10.1016/j.ejcb.2020.151149
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Microautophagy in the yeast vacuole depends on the activities of phosphatidylinositol 4-kinases, Stt4p and Pik1p (2020)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa Yuna、Konishi Rikako、Yoshida Akane、Tomioku Kanna、Tanabe Kenji、Fujita Akikazu
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 巻: 1862 号: 11 ページ: 183416-183416
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2020.183416
  • 査読あり
• [雑誌論文] Essential and distinct roles of phosphatidylinositol 4-kinases, Pik1p and Stt4p, in yeast autophagy (2019)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa, Y., Konishi, R., Yoshida, A., Fujii, E., Tomioku, K., Futagami, T., Tamaki, H., Tanabe, K., Fujita, A.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta. Mol. Cell Biol. Lipids. 巻: 1864 号: 9 ページ: 1214-1225
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2019.05.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predominant localization of phosphatidylserine at the cytoplasmic leaflet of the ER, and its TMEM16K-dependent redistribution (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsuji, T., Cheng, J., Tatematsu, T., Ebata, A., Kamikawa, H., Fujita, A., Gyobu, S., Segawa, K., Arai, H., Taguchi, T., Nagata, S., Fujimoto, T.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 巻: 116 ページ: 13368-13373
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nanoscale analysis reveals no domain formation of glycosylphosphatidylinositol-anchored protein SAG1 in the plasma membrane of living Toxoplasma gondii (2019)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa et al.
  • 雑誌名: Histchem Cell Biol 巻: 152 号: 5 ページ: 365-375
  • DOI: 10.1007/s00418-019-01814-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphatidylinositol 4‐phosphate on Rab7‐positive autophagosomes revealed by the freeze‐fracture replica labeling (2018)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa Yuna、Yoshida Akane、Fujii Emi、Tomioku Kanna、Hayashi Hiroki、Tanabe Kenji、Fujita Akikazu
  • 雑誌名: Traffic 巻: 20 号: 1 ページ: 82-95
  • DOI: 10.1111/tra.12623
  • 査読あり
• [学会発表] 酵母細胞でのオートファジーにおけるオートファジックボディーの選択的崩壊機構とオートファジックボディー膜におけるホスファチジルセリンの選択的増加 (2022)
  • 著者名/発表者名: 山口優希、黒川夕奈、向達汐美、福田佳代子、正谷達謄、藤田秋一
  • 学会等名: 第96回 日本生化学大会
• [学会発表] ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumでのラフト主成分の糖脂質GM3の局在 (2022)
  • 著者名/発表者名: 向達 汐美, 正谷 達謄, 小西 里可子, 黒川 夕奈, 山口 優希, 富奥 甘奈, 福田 佳代子, ハキミ ハッサン, 麻田 正仁, 金子 修, 藤田 秋一
  • 学会等名: 第96回 日本生化学大会
• [学会発表] 酵母細胞でのautophagosome膜およびautophagic body膜における膜脂質の微細分布解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山口優希、黒川夕奈、向達汐美、福田佳代子、正谷達謄、藤田秋一
  • 学会等名: 第９４回 日本生化学会大会
• [学会発表] ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumの細胞膜ではラフト主成分の糖脂質GM3は内葉と外葉の両方に局在する (2021)
  • 著者名/発表者名: 向達汐美、正谷達謄、小西里可子、黒川夕奈、山口優希、富奥甘奈、福田佳代子、Hakimi Hassan、麻田正仁、金子修、藤田秋一
  • 学会等名: 第９４回 日本生化学会大会
• [学会発表] 急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を用いた酵母細胞膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PI(4,5)P2）の局在解析による、PI(4,5)P2生成の制御機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 黒川夕奈、小西里可子、富奥甘奈、藤田秋一
  • 学会等名: 第９４回 日本生化学会大会
• [学会発表] 酵母の液胞のミクロオートファジーにおけるホスファチジルイノシトール4キナーゼ(Stt4p、Pik1p)の役割 (2020)
  • 著者名/発表者名: 黒川夕奈、小西里可子、富奥甘奈、藤田秋一
  • 学会等名: 第９３回 日本生化学大会
• [学会発表] 電子顕微鏡を用いたトキソプラズマ原虫の生体膜における脂質分子の微細局在解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小西里可子、黒川夕奈、富奥甘奈、藤田秋一
  • 学会等名: 第９３回 日本生化学大会
• [学会発表] 酵母および哺乳類細胞におけるホスファチジルイノシトール４キナーゼの役割 (2019)
  • 著者名/発表者名: 黒川夕奈、小西理可子、富奥甘奈、藤田秋一
  • 学会等名: 日本生化学会
• [学会発表] 免疫電顕法を用いたヒト細胞感染トキソプラズマ生体膜における脂質分子の微細局在の検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 小西理可子、黒川夕奈、富奥甘奈、正谷達謄、藤田秋一
  • 学会等名: 日本生化学会
• [備考] 鹿児島大学 共同獣医学部 分子細胞生物学 藤田秋一研究室
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• [備考] 鹿児島大学共同獣医学部分子細胞生物学藤田秋一研究室
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