研究課題
挑戦的研究(萌芽)
本研究では急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を改良することにより、逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発し、膜脂質の疎水性領域である各種脂肪酸の微細分布の解析を可能にすることを目的とする。近年、不飽和脂肪酸(UFA)の生体内での増加が発癌、癌転移、精神疾患、インスリン抵抗性の改善など種々の生理機能に関与することがわかってきた。UFAは食物による補給により作用が発揮されることもわかっているが、どのように細胞に作用して機能関与するのかなど作用機序は全く不明である。逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発することにより、世界に先駆けて、UFAがもたらす生理的作用の機序解明の基礎的情報を獲得できると確信する。
申請者らは脂質の超微局在を明らかにすることが、膜脂質の機能を解明するために必須であると考え、そのための方法開発に注力してきた。その結果、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法(QF-FRL: Quick Freezing & Freeze-fracture Labeling)によって膜脂質を特異的に標識することが可能であることを示し、生体膜脂質の二次元的分布をナノレベルで定量的に解明することに成功した。このQF-FRL法が識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、膜脂質の多様性のもう一つの要因である“疎水性尾部”の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。本研究では、現在用いているQF-FRL法をさらに改良することにより、凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに改良し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析することを可能にする。哺乳類培養細胞あるいは培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、そしてクリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することができた。標識方法を確立するために、まず蛍光標識法で行い光学顕微鏡を用いて解析し、最適な条件を確定した。具体的には、市販されているアルキン化オレイン酸(1価不飽和脂肪酸)を用いて培養細胞において蛍光標識することに成功した。アルキン化オレイン酸を哺乳類培養細胞に取り込ませた後、アルデヒドで固定しbiotin-azideと反応させることにより、蛍光標識を得ることができた。ラット膵臓の培養組織における不飽和脂肪酸の標識には、培養細胞と同様の方法を用い、外来性に投与した不飽和脂肪酸の蛍光標識の条件検討を行い、不飽和脂肪酸の標識ができる条件を見出すことができた。
3: やや遅れている
当初、計画していた培養細胞および組織標本において、アルキン化不飽和脂肪酸を培養液中に入れて、細胞あるいは組織細胞内に取り込ませた後、蛍光標識法によって、細胞内での不飽和脂肪酸の局在を観察することに成功した。また、当初の計画であった、アルキン化不飽和脂肪酸を取り込ませた培養細胞を急速凍結し、凍結割断レプリカを作成して、レプリカ膜上での不飽和脂肪酸の標識を電子顕微鏡を用いて不飽和脂肪酸の局在を観察する条件検討をしたが、最適な条件を見出しすることができず、レプリカ上で脂肪酸の標識をすることができなかった。
今後の研究では、脂肪酸分布解析技術開発のため、脂質の脂肪酸領域を露出することができる凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発・確立する。基本的に従来の急速凍結・凍結割断レプリカ標識(QF-FRL)法を応用し、凍結割断後、エッチングすることでリン脂質の親水性頭部に面した氷を昇華させることにより親水性頭部を露出させる。その後、白金と炭素を蒸着すると疎水性の脂肪酸がむき出しになったレプリカ薄膜が形成される。レプリカ膜上での脂肪酸標識にはクリックケミスストリー法を用いて、脂肪酸をレプリカ膜上で標識することができる最適条件を検討する予定である。
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