高感度レポーターシステムとプロテオゲノミクスによる代謝性骨疾患治療標的分子の同定

• 研究課題/領域番号: 19KK0234
• 研究種目: 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分57:口腔科学およびその関連分野
• 研究機関: 松本歯科大学
• 研究代表者: 中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (20350829)
• 研究分担者: 宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801) ; 荒井 敦 松本歯科大学, 歯学部, 准教授 (00532772) ; 堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (70733509) ; 岩本 莉奈 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 助教 (20907216)
• 研究期間 (年度): 2019-10-07 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円); 2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円); 2021年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円); 2020年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円); 2019年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
• キーワード: 高感度レポーターシステム / プロテオゲノミクス / Wnt / 骨芽細胞

研究開始時の研究の概要

Wntシグナルの破綻は様々な病態をもたらす。疾患モデルにおけるWntシグナルのプロテオゲノミクス解析は、重要な発見をもたらしてきた。しかしどのWntシグナル分子が骨形成に重要か不明な点が多い。本研究では、海外共同研究者Major博士の研究室で開発した解析システムを利用して、骨形成におけるWntシグナル調節因子を①ゲノムワイド遺伝子機能獲得アプローチであるCrispr-Aスクリーニング、②リン酸化質量分析、および③活性化リン酸化酵素を定量するmultiplexed kinase inhibitor beads-質量分析、により同定する。本統合的解析により代謝性骨疾患の治療薬標的分子を決定する。

研究実績の概要

どのWntシグナル分子が骨形成に重要か不明な点が多い。2022年度は、2021年度までに本研究において質量分析リン酸化プロテオーム解析によりWntシグナル依存的にTGFbetaファミリーサイトカインのリン酸化が有意に亢進していたことを見出していたので、この分子の解析に注力した。具体的には、公開疾患情報により、このTGFbetaファミリー分子とWntシグナルが慢性腎臓病(CKD)に伴うミネラル骨代謝異常(MBD)の増悪に関与していることが、判明していたため、2021年度までにリン酸化プロテオミクスで同定したTGFbシグナルの挙動、Wnt阻害因子の発現変化について解析した。そして、骨髄間葉系細胞の骨芽細胞分化および脂肪細胞分化過程の双方において、TGFbeta ファミリーのシグナルが大きく変動していることがわかった。CKD-MBDモデルにおいて、このTGFbetaファミリー分子とWnt阻害因子のmRNA発現が骨において低下しているにもかかわらず、それらの血中濃度が著しく上昇していることを見出した。CKD-MBDでは、骨形成が低下するものの反対に軟組織の石灰化が亢進する。このTGFbetaファミリー分子とWnt阻害因子は、軟組織の石灰化に寄与することも想定されたので、そのための実験も行った。さらには、WntレポーターマウスであるAxin2-tomatoマウスを用いた骨折治癒モデルにおいて、骨折過程において間葉系細胞でWntシグナルの活性化を検出し、Wntの下流でこのTGFbataファミリーの分子のmRNA発現が亢進していることを見出した。したがって、このTGFbataファミリーの高リン酸化は骨形成促進に寄与し、治癒促進に貢献している可能性がある。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

これまでCovid-19の蔓延のため、共同研究先への長期滞在が困難であり、実験実施に必須となるvisaの手続きが出来ず、客員研究員としても身分を得ることが出来なかった。したがって昨年度までに、共同研究先の本課題の共同研究者が質量分析によるリン酸化プロテオーム解析で同定したWnt依存的なTGFbetaファミリー高リン酸化ペプチドの意義を見出すための傍証実験を日本国内で行ってきた。私が共同研究先において以前に構築したゲノムワイドCrisprスクリーニング系のNGS解析は中断したままである。つまり肝心のゲノミクス解析の方は中断している。国内で行ったリン酸化プロテオーム解析の傍証実験において、骨折治癒の骨形成の過程で、このTGFbetaファミリー分子の高リン酸化がWntシグナルの下流で重要な働きを持つ可能性を見出すことが出来た。

今後の研究の推進方策

2023年度は、Visaの取得を行い海外共同研究先において、構築したスクリーニング系で生き残った細胞のNGS解析をすすめる。最近になって、Wnt3a以外の骨形成促進に関わるWntリガンドと分泌性Wnt antagonistの相互作用が構造化学的に明らかになってきた。我々は、成長期および大人の骨の恒常性には、Wnt3a以外のWntリガンドが重要であることを示唆するデータを得た。今年度は、Wnt3a以外のWntリガンドを骨形成促進因子として用い、すでに代表者が確立したCrispr-Cas9によるゲノムワイドWntシグナルスクリーニング系を用いて、Wnt3aの時と同様のスクリーニングを行い、成長期および大人の骨形成に重要な因子を同定する予定である。また、今回同定されたWntシグナル依存的なTGFbetaファミリー分子のリン酸化の意義を、リン酸化部位変異タンパクをST2細胞などの未分化間葉系細胞に過剰発現させることで解明する予定である。また、WntとこのTGFbetaファミリー分子の関係がカルシウム代謝におけるCKD-MBDの病態制御シグナルとして関与しているか検証する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] セントルイス・ワシントン大学(米国)
• [国際共同研究] セントルイス・ワシントン大学(米国)
• [国際共同研究] セントルイス・ワシントン大学(米国)
• [国際共同研究] セントルイス・ワシントン大学(米国)
• [国際共同研究] マックスプランク研究所(ドイツ)
• [雑誌論文] Angiotensin II induces aortic rupture and dissection in osteoprotegerin-deficient mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Tsuruda T, Yamashita A, Otsu M, Koide M, Nakamichi Y, Sekita-Hatakeyama Y, Hatakeyama K, Funamoto T, Chosa E, Asada Y, Udagawa N, Kato J, Kitamura K
  • 雑誌名: Journal of the American Heart Association 巻: 11 号: 8
  • DOI: 10.1161/jaha.122.025336
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] WNT/RYK signaling functions as an antiinflammatory modulator in the lung mesenchyme (2022)
  • 著者名/発表者名: Kim Hyun-Taek、Panza Paolo、Kikhi Khrievono、Nakamichi Yuko、Atzberger Ann、Guenther Stefan、Ruppert Clemens、Guenther Andreas、Stainier Didier Y. R.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 巻: 119 号: 24
  • DOI: 10.1073/pnas.2201707119
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Influence of vitamin D on sarcopenia pathophysiology: A longitudinal study in humans and basic research in knockout mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Mizuno Takafumi、Hosoyama Tohru、Tomida Makiko、Yamamoto Yoko、Nakamichi Yuko、Kato Shigeaki、Kawai‐Takaishi Minako、Ishizuka Shinya、Nishita Yukiko、Tange Chikako、Shimokata Hiroshi、Imagama Shiro、Otsuka Rei
  • 雑誌名: Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 巻: 13 号: 6 ページ: 2961-2973
  • DOI: 10.1002/jcsm.13102
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RANKL/OPG ratio regulates odontoclastogenesis in damaged dental pulp (2021)
  • 著者名/発表者名: Daisuke Nishida , Atsushi Arai , Lijuan Zhao , Mengyu Yang , Yuko Nakamichi , Kanji Horibe , Akihiro Hosoya , Yasuhiro Kobayashi , Nobuyuki Udagawa , Toshihide Mizoguchi
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 11(1) 号: 1 ページ: 4575-4575
  • DOI: 10.1038/s41598-021-84354-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effector memory CD4+T cells in mesenteric lymph nodes mediate bone loss in food-allergic enteropathy model mice, creating IL-4 dominance (2021)
  • 著者名/発表者名: Ono-Ohmachi Aiko、Udagawa Nobuyuki、Nakamichi Yuko、Koide Masanori、Nakajima-Adachi Haruyo
  • 雑誌名: Mucosal Immunology 巻: 14 号: 6 ページ: 1335-1346
  • DOI: 10.1038/s41385-021-00434-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Osteoclast differentiation by RANKL and OPG signaling pathways (2020)
  • 著者名/発表者名: Udagawa Nobuyuki、Koide Masanori、Nakamura Midori、Nakamichi Yuko、Yamashita Teruhito、Uehara Shunsuke、Kobayashi Yasuhiro、Furuya Yuriko、Yasuda Hisataka、Fukuda Chie、Tsuda Eisuke
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism 巻: 39 号: 1 ページ: 19-26
  • DOI: 10.1007/s00774-020-01162-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The Vitamin D Receptor in Osteoblast-Lineage Cells Is Essential for the Proresorptive Activity of 1α,25(OH)2D3 In Vivo (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Mori, Kanji Horibe, Masanori Koide, Shunsuke Uehara, Yoko Yamamoto, Shigeaki Kato, Hisataka Yasuda, Naoyuki Takahashi, Nobuyuki Udagawa, Yuko Nakamichi
  • 雑誌名: Endocrinology . 巻: 161 号: 11 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1210/endocr/bqaa178
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Vitamin D in The Regulation of Osteoclasts (2020)
  • 著者名/発表者名: Takahashi Naoyuki、Nakamichi Yuko、Udagawa Nobuyuki
  • 雑誌名: Encyclopedia of Bone Biology 巻: 1 ページ: 290-302
  • DOI: 10.1016/b978-0-12-801238-3.62204-3
  • ISBN: 9780128140826
  • 査読あり
• [雑誌論文] WNT/RYK signaling restricts goblet cell differentiation during lung development and repair (2019)
  • 著者名/発表者名: Kim Hyun-Taek、Yin Wenguang、Nakamichi Yuko、Panza Paolo、Grohmann Beate、Buettner Carmen、Guenther Stefan、Ruppert Clemens、Kobayashi Yasuhiro、Guenther Andreas、Stainier Didier Y. R.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 116 号: 51 ページ: 25697-25706
  • DOI: 10.1073/pnas.1911071116
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Blockade of the angiotensin II type 1 receptor increases bone mineral density and left ventricular contractility in a mouse model of juvenile Paget disease. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsuruda T, Funamoto T, Udagawa N, Kurogi S, Nakamichi Y, Koide M, Chosa E, Asada Y, Kitamura K
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol 巻: 859 ページ: 172519-172519
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2019.172519
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] WNT Activates the AAK1 Kinase to Promote Clathrin-Mediated Endocytosis of LRP6 and Establish a Negative Feedback Loop (2019)
  • 著者名/発表者名: Agajanian MJ, Walker MP, Axtman AD, Ruela-de-Sousa RR, Serafin DS, Rabinowitz AD, Graham DM, Ryan MB, Tamir T, Nakamichi Y, Gammons MV, Bennett JM, Counago RM, Drewry DH, Elkins JM, Gileadi C, Gileadi O, Godoi PH, Kapadia N, Muller, Santiago A, Sorrell FJ, Wells CI, Fedorov O, Willson TM, Zuercher WJ, Major MB.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 26 号: 1 ページ: 79-93.e8
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2018.12.023
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] The vitamin D receptor in osteoblastic cells is crucial for the proresorptive activity, hypercalcemia, and soft tissue calcification, induced by 1α,25(OH)2D3 (2022)
  • 著者名/発表者名: Yuko Nakamichi, Tomoki Mori, Hisataka Yasuda, Naoyuki Takahashi, Nobuyuki Udagawa
  • 学会等名: Vitamin D Workshop (24th)
  • 国際学会
• [学会発表] 食物アレルギー性腸炎併発骨量減少におけるIL-4の役割の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 玉井雅人，宇野智，山田悟生，中村翔太郎，曽我皓平，中道裕子，小出雅則，高野智弘，宇田川信之，清野宏，八村敏志，足立(中嶋)はるよ
  • 学会等名: 2022年度日本農芸化学会京都大会
• [学会発表] 骨芽細胞のビタミンD受容体（VDR）は、過剰なビタミンDによる病態発現において決定的な役割を果たす (2022)
  • 著者名/発表者名: 中道裕子、劉子洋、森 智紀、宇田川信之
  • 学会等名: 第7回日本骨免疫学会冬期学術集会
• [学会発表] 骨芽細胞・骨細胞のビタミンD受容体(VDR)は、in vivoにおいても活性型ビタミンDによる骨吸収促進作用に不可欠である (2022)
  • 著者名/発表者名: 中道裕子
  • 学会等名: 第６回日本骨免疫学会ウインタースクール
• [学会発表] ビタミンDの骨組織における役割とは？ (2022)
  • 著者名/発表者名: 宇田川信之
  • 学会等名: 第６回日本骨免疫学会ウインタースクール
  • 招待講演
• [学会発表] RANKL/OPG比は損傷した歯髄における破歯細胞形成を調節する (2021)
  • 著者名/発表者名: 西田大輔，荒井敦，堀部寛治，中道裕子，細矢明宏，中村浩彰，小林泰浩，宇田川信之，溝口利英
  • 学会等名: 第39回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] マクロファージはLepR陽性細胞を活性化し骨再生を促進する (2021)
  • 著者名/発表者名: 何治鋒，溝口利英，平賀徹，村上康平，中道裕子，山下照仁，小出雅則，宇田川信之，小林泰浩
  • 学会等名: 第39回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] 骨ミネラル代謝におけるビタミンDとWntシグナルの作用機序の解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 中道裕子
  • 学会等名: 第460回 東京歯科大学 大学院セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 心血管保護因子としてのオステオプロテゲリン (2020)
  • 著者名/発表者名: 鶴田敏博，小出雅則，中道裕子，中村美どり，宇田川信之，北村和雄
  • 学会等名: 第62回歯科基礎学会学術大会
• [学会発表] BMP 誘導性の異所性骨における骨形成抑制因子スクレロスチン陽性細胞の経時的観察 (2020)
  • 著者名/発表者名: 松下雅衣，小出雅則，芳澤享子，堀部寛治，小林泰浩，山下照仁，中道裕子， 上原俊介，宇田川信之
  • 学会等名: 第38回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] 活性型ビタミンD3のin vivo大量投与による骨吸収促進と血清Ca値上昇作用は、骨芽細胞のVDRを介する (2020)
  • 著者名/発表者名: 森 智紀，堀部寛治，小出雅則，高橋直之，宇田川信之，中道裕子
  • 学会等名: 第5回 日本骨免疫学会ウインタースクール
• [学会発表] ビタミンDによる骨代謝共役-骨芽細胞のVDRを介した骨吸収抑制効果と促進効果 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中道裕子
  • 学会等名: 第37回日本骨代謝学会学術集会
  • 招待講演
• [備考] USACO 日本人論文詳細
  • URL: https://www.usaco.co.jp/article/detail.html?itemid=1347&dispmid=610
• [備考] 日本骨代謝学会 1st Author
  • URL: http://www.jsbmr.jp/1st_author/431_nakamichi_mori.html