| 研究課題/領域番号 |
19KK0409
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| 研究種目 |
国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))
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| 配分区分 | 基金 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
加藤 文紀 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (70452589)
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| 研究期間 (年度) |
2020 – 2023
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
15,210千円 (直接経費: 11,700千円、間接経費: 3,510千円)
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| キーワード | 黄色ブドウ球菌 / トキシン・アンチトキシン / 生育阻害 / DNAジャイレース / トキシン・アンチトキシン システム / DNAトポロジー / 細胞死 / 感染症治療 / トキシン・アンチトキシンシステム / DNAトポイソメラーゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
薬剤耐性黄色ブドウ球菌の蔓延は全世界的な公衆衛生上の問題となっており、新たな感染症治療薬の開発が必要とされている。細菌は自身の細胞死を制御するトキシン・アンチトキシン(TA)システムを有しており、申請者はDNAトポイソメラーゼを制御する黄色ブドウ球菌の新規なTAシステムをこれまでに見出している。本国際共同研究では、トキシンの作用機序を分子レベルで解明することにより、抗菌薬の新たな分子標的の候補探索を行う。さらに、黄色ブドウ球菌の新規TAシステムの機能を標的としたリード化合物の探索により、新規抗菌薬の開発研究を行う。
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| 研究実績の概要 |
黄色ブドウ球菌はヒトの常在菌であるが、多剤薬剤耐性菌の蔓延は全世界的な攻守衛生上の問題となっており、既存の抗菌薬の作用機序とは異なる新たな感染症治療薬・治療法の開発が必要となっている。
トキシン・アンチトキシン(TA)システムは、ほぼ全ての細菌が保有しており、細菌自身の生存に必須な細胞機能を停止させることで細胞分裂の停止および細胞死を誘導するトキシンと、そのトキシン活性を中和するアンチトキシンから成る。本研究では、我々が見出した黄色ブドウ球菌のTAシステムであるTsbA/TsbTの作用機序・機能の解明により、TAシステムを利用した黄色ブドウ球菌の新規感染症治療薬の開発および新規抗菌薬開発に有効な情報基盤の提供を目指す。これまでの研究により、黄色ブドウ球菌のTAシステムであるTsbTトキシンはDNAトポイソメラーゼの一種であるDNAジャイレースの活性を阻害することを明らかにしており、当該年度は、昨年度から11月末まで海外研究機関（米国・ニュージャージー州立ラトガース大学）にて研究滞在し、以下の国際共同研究を進めた。１）TsbTトキシンがDNAジャイレース活性を阻害すること、およびトキシン活性に重要なアミノ酸残基と二次構造を報告した(The FEBS Journal, 2023)。２）TsbTトキシンによるDNAジャイレース活性阻害機構を詳細に解明するため、TsbTトキシンタンパク質とDNAジャイレースタンパク質、またはTsbAアンチトキシンタンパク質とのタンパク質ータンパク質相互作用の解析を試みた。３)TsbTトキシンにレポータータンパク質を融合させTsbTトキシンが発現、機能する生理的な条件およびリード化合物探索のための実験系の構築を実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
TsbTトキシンとDNAジャイレースとのタンパク質ータンパク質間相互作用の解明を行うため、大腸菌を用いてDNAジャイレースのタンパク質精製を試みたが、DNAジャイレースのサブユニットの一つであるGyrAタンパク質全長を十分に産生させることができず、十分なタンパク質精製が行えなかった。種々の検討を行った結果、大腸菌のレアコドン補充株であるRosseta-gami2 pLysSを用いることでGyrAサブユニットの十分量のタンパク質産生・精製が可能となった。今後、既に精製しているGyrBサブユニットと共にTsbTトキシンとの相互作用解析を進めることで、詳細なDNAジャイレース活性阻害機構を解明する。また、TsbTトキシンタンパク質の発現をレポータータンパク質としてGFPまたはFLAGタグを用いてレポーターアッセイ解析するため、黄色ブドウ球菌のコドン使用頻度に最適したGFPタンパク質またはFLAGタグを融合させたTsbT遺伝子を作製した。しかしながら、現時点でTsbTトキシンの発現を誘導する生理的な条件を見出せていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の研究計画から遅れていることから、補助事業期間を延長し、黄色ブドウ球菌のTsbA/TsbTトキシン・アンチトキシンシステムを生理的た役割の解明およびTsbTのトキシン活性を利用した新規感染症治療薬の開発に向けて、精製したTsbTトキシンタンパク質と、DNAジャイレースタンパク質およびTsbAアンチトキシンタンパク質間の分子間相互作用部位の決定を行う。さらに得られた結果から、バイオインフォマティクスによるDNAジャイレースの作用部位に対する化合物の探索を行う。また、TsbTタンパク質の発現をレポーターアッセイにて解析することでTsbTトキシン活性を誘導する低分子リード化合物の探索を行う。加えて、抗菌薬作用時のTAシステム遺伝子の発現パターン解析、RNA seq法による抗菌薬作用時の網羅的遺伝子発現比較解析により、TsbA/TsbTトキシン・アンチトキシンシステムの生理的な役割についても継続的に進める。
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