| 研究課題/領域番号 |
20390445
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
耳鼻咽喉科学
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
池田 勝久 順天堂大学, 医学部, 教授 (70159614)
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| 研究分担者 |
美野 輪治 (美野輪 治) 理化学研究所, 上級研究員 (00181967)
楠 威志 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30248025)
古川 正幸 順天堂大学, 医学部, 准教授 (20359524)
横井 秀格 順天堂大学, 医学部, 准教授 (80317487)
小池 卓二 (小池 卓也) 電気通信大学, 電気通信学部, 准教授 (10282097)
神谷 和作 順天堂大学, 医学部, 講師 (10374159)
欠畠 誠治 (欠畑 誠治) 順天堂大学 (90261619)
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| 研究期間 (年度) |
2008 – 2010
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| 研究課題ステータス |
完了 (2010年度)
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| 配分額 *注記 |
19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)
2010年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2009年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2008年度: 7,150千円 (直接経費: 5,500千円、間接経費: 1,650千円)
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| キーワード | GJB2 / 難聴 / ノックアウトマウス / コルチ器 / 内耳 / 蝸牛 / 内リンパ / 半規管 / アデノウイルスベクター / アデノ随伴ウイルスベクター / 聴性脳幹反応 / GJB2遺伝子 / 遺伝子導入 / ウイルスベクター / アデノウイル / アデノ随伴ウイル |
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| 研究概要 |
本研究では独自の遺伝子改変難聴モデル動物を用い効果的な細胞導入法およびウイルスベクターを用いた遺伝子治療法を開発するため、以下の実験により良好な結果が得られている。移植用幹細胞の作製:移植用骨髄間葉系幹細胞(MSC)作製のため、C57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞株にEGFP遺伝子(緑色蛍光)をレトロウイルスにて発現させ、安定的に強度な蛍光を発する細胞を選抜クローニングした。新規Connexin26(Cx26)欠損マウスの作製:P0プロモーターを用いたCre-loxPシステムにより内耳特異的にCx26遺伝子を欠損するマウスを新規開発した。Brn-4欠損マウスの作製:癌研究所(東京、有明)にて凍結保存したBrn-4欠損マウスの受精卵を順天堂大学動物施設にて融解し、C57BL/6J系統のレシピエントマウスに移植してBrn-4欠損マウスの個体を得た。これらの交配、遺伝子タイピングによる選抜により大量の同欠損マウスを作製中である。幹細胞の経半規管移植:後半規管および外側半規管に小孔をあけ、後半規管より2x105cells を還流した。移植細胞の検出:経半規管移植後の組織をGFP蛍光検出により移植細胞の組織進入を解析し、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。更に蝸牛線維細胞に選択的障害を与えることにより細胞導入効率が大幅に上昇した。更にこの誘導機構の解析により、ケモカインMCP1とその受容体CCR2による誘導機序が示唆されたため、CCR2遺伝子を内耳より単離し発現用プラスミドを構築した。これを移植細胞に導入したところ、細胞生着効率が飛躍的に向上した。更に我々はCx26遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルスを作製し、Cx26欠損マウスへの遺伝子導入を行った。その結果外側壁線維細胞においてCx26を発現させることに発現に成功した。これらの条件検討を推進することにより新規細胞治療法がCx26変異等による遺伝性難聴に対する更に効果の高い治療法として聴力改善につながると考えられる。
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