表皮幹細胞と羊膜を利用した三次元培養皮膚の簡便大量作製法の開発

• 研究課題/領域番号: 20591347
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 皮膚科学
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 亀田 健治 愛媛大学, 総合科学研究支援センター, 講師 (60363264)
• 研究分担者: 白方 裕司 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (50226320)
• 研究期間 (年度): 2008 – 2010
• 研究課題ステータス: 完了 (2010年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2010年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2009年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2008年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: 皮膚炎症 / 再生学 / 表皮幹細胞 / 羊膜 / SP細胞 / セルソーター / 三次元培養

研究概要

簡便な三次元培養皮膚作製法を開発する目的で表皮幹細胞と羊膜に注目した。角化細胞の幹細胞としてはSP細胞について解析した。至適条件を検討したところ、ヘキスト33342の濃度は10μg/mlで37度、60分の染色がもっともよいことが明らかとなった。そこで継代数の異なる細胞を同時に培養し、SP細胞の比率について検討したところ、継代をかさねるとSP細胞の比率が低下することが明らかとなった。すなわち幹細胞を用いた培養皮膚作製については継代の少ない細胞集団からSP細胞を分離する必要があることが明らかとなった。真皮成分に相当する材料として羊膜に着目し、簡便な三次元培養皮膚の作製が可能であるかどうか検討した。正常ヒト線維芽細胞をコラーゲンゲル中で培養し、羊膜をゲルの上に密着させ、角化細胞を播種した。2日後に空気に曝露することにより重層化させた。病理組織所見では、基底細胞がコンパクトであり、その配列は正常皮膚により近いものであった。免疫組織学的検索では、羊膜付き三次元皮膚では基底膜成分は良好に発現しており、正常皮膚に非常に近いものであった。羊膜を用いることで良好な培養皮膚の作製が可能であった。

研究成果

• [雑誌論文] E2 Polyubiquitin-conjugating enzyme Ubc13 in keratinocytes is essential for epidermal integrity. (2010)
  • 著者名/発表者名: Sayama K, Yamamoto M, Shirakata Y, Hanakawa Y, Hirakawa S, Dai X, Tohyama M, Tokumaru S, Shin MS, Sakurai H, Akira S, Hashimoto K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 285(39) ページ: 30042-30049
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inflammatory mediator TAK1 regulates hair follicle morphogenesis and anagen induction shown by using keratinocyte-specific TAK1-deficient mice. (2010)
  • 著者名/発表者名: Sayama K, Kajiya K, Sugawara K, Sato S, Hirakawa S, Shirakata Y, Hanakawa Y, Dai X, Ishimatsu-Tsuji Y, Metzger D, Chambon P, Akira S, Paus R, Kishimoto J, Hashimoto K.
  • 雑誌名: PLoS One. 23;5(6)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulation of epidermal keratinocytes by growth factors. (2010)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y.
  • 雑誌名: J Dermatol Sci. 59(2) ページ: 73-80
  • NAID: 10027401602
  • 査読あり
• [雑誌論文] Auto- and cross-induction by betacellulin in epidermal keratinocytes. (2010)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Tokumaru S, Sayama K, Hashimoto K.
  • 雑誌名: J Dermatol Sci. 58(2) ページ: 162-164
  • NAID: 10027400978
  • 査読あり
• [雑誌論文] Possible Roles of IL-27 in the Pathogenesis of Psoriasis. (2010)
  • 著者名/発表者名: Shibata S, Tada Y, Kanda N, Nashiro K, Kamata M, Karakawa M, Miyagaki T, Kai H, Saeki H, Shirakata Y Tamaki K, Sato S.
  • 雑誌名: J Invest Dermatol. 130(4) ページ: 1034-1039
  • 査読あり
• [雑誌論文] Living Skin Equivalents Constructed Using Human Amnions as a Matrix. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yang L, Shirakata Y, Tokumaru S, Xiuju D, Tohyama M, Hanakawa Y, Hirakawa S, Sayama K, Hashimoto K
  • 雑誌名: J Dermatol Sci. 56 ページ: 188-195
  • NAID: 10027398843
  • 査読あり
• [雑誌論文] IL-17 and IL-22 mediate IL-20 subfamily cytokine production in cultured keratinocytes via increased IL-22 receptor expression. (2009)
  • 著者名/発表者名: Tohyama M, Hanakawa Y, Shirakata Y, Dai X, Yang L, Hirakawa S, Tokumaru S, Okazaki H, Sayama K, Hashimoto K.
  • 雑誌名: Eur J Immunol. 39 ページ: 2279-2288
  • 査読あり
• [雑誌論文] UVB wavelength dependency of antimicrobial peptide induction for innate immunity in normal human keratinocytes. (2009)
  • 著者名/発表者名: Torii K, Maeda A, Saito C, Furuhashi T, Shintani Y, Shirakata Y, Morita A.
  • 雑誌名: J Dermatol Sci. 56 ページ: 217-219
  • NAID: 10027398979
  • 査読あり
• [雑誌論文] Alteration of TLR3 pathways by glucocorticoids may be responsible for immunosusceptibility of human corneal epithelial cells to viral infections. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiraishi A, Kobayashi T, Kadota Y, Shirakata Y, Hashimoto K, Ohashi Y.
  • 雑誌名: Mol Vis. 15 ページ: 937-948
  • 査読あり
• [雑誌論文] The NF-kB, p38 MAPK and STAT1 pathways differentially regulate the dsRNA-mediated innate immune responses of epidermal keratinocytes. (2008)
  • 著者名/発表者名: Dai X, Sayama K, Tohyama M, Shirakata Y, Yang L, Hirakawa S, Tokumaru S, Hashimoto K.
  • 雑誌名: Int Immunol. 20 ページ: 901-909
  • 査読あり
• [雑誌論文] PPARgamma is an important transcription factor in 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3-induced involucrin expression. (2008)
  • 著者名/発表者名: Dai X, Sayama K, Shirakata Y, Tokumaru S, Yang L, Tohyama M, Hirakawa S, Hanakawa Y, Hashimoto K.
  • 雑誌名: J Dermatol Sci 50 ページ: 53-60
  • 査読あり
• [学会発表] Deletion of SOCS3 in the epidermis causes impaired skin wound healing in vivo. (2010)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Yang L, Tsuda T, Tohyama M, Miyawaki S, Kameda K, Sayama K, Yoshimura A, Hashimoto K.
  • 学会等名: The 40^h Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • 発表場所: Helsinki, Finland
• [学会発表] Interferon alpha enhances IL-22 receptor expression on epidermal keratinocytes. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tohyama M, Yang L, Tsuda T, Miyawaki S, Shirakata Y, Sayama K, Hashimoto K.
  • 学会等名: The 40^h Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • 発表場所: Helsinki, Finland
• [学会発表] Development of a new skin equivalent using de-epithelialized amnion membrane. (2009)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Hashimoto K.
  • 学会等名: The 4^<th> Joint Meeting of Japanese Dermatological Association and Australasian College of Dermatologists
  • 発表場所: Sapporo
• [学会発表] Simple method of constructing living skin equivalent using human amnion as dermal matrix. (2009)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Yang L, Sayama K, Hashimoto K.
  • 学会等名: The 39^<th> Annual Meeting of European Society for Dermatological Research
  • 発表場所: Budapest, Hungary
• [学会発表] Inflammatory mediator TAK1 regulates hair follicle cycling. (2009)
  • 著者名/発表者名: Sayama K, Shirakata Y, Ishimatsu-Tsuji Y, Kajiya K, Hirakawa S, Sugawara K, Chambon P, Akira S, Paus R, Kishimoto J, Hashimoto K.
  • 学会等名: The 69^<th> Annual Meeting of Society for Investigative Dermatology
  • 発表場所: Montreal, Canada
• [備考] ホームページ等