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変性タンパク質の可溶化技術を活用した細胞内イメージング技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号 20650070
研究種目

挑戦的萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 医用生体工学・生体材料学
研究機関岡山大学

研究代表者

山田 秀徳  岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (80037613)

研究分担者 二見 淳一郎  岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 准教授 (00420498)
研究期間 (年度) 2008 – 2009
研究課題ステータス 完了 (2009年度)
配分額 *注記
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2009年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2008年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
キーワードバイオテクノロジー / 生物・生体工学 / 蛋白質 / 細胞内イメージング / 化学修飾 / 細胞・組織 / ケミカルバイオロジー / 巻き戻し
研究概要

(1) N末端特異的な蛍光標識による高精細な細胞内イメージング
平成20年度に細胞内イメージングのモデルタンパク質としてN末端特異的に蛍光基を標識したβアクチンタンパク質を可逆的変性カチオン化法により高い水溶性を保持した蛍光標識プローブを調製することに成功していた。本年度はマイクロインジェクション法で細胞内への注入を試みたが、培地中で蛍光標識プローブが重合しやすく極めて困難であった。そこで蛍光標識プローブの溶解度向上に向けた諸条件を検討した結果、新規カチオン化試薬:TAP3S-Sulfonateの利用で高い溶解性が得られた。また、逆相HPLCで高純度に精製することで、純水および生理食塩水中で高い溶解度を維持できることを見出し、本手法に適した蛍光標識プローブの調製方法を確立した。
(2) 細胞内分泌経路のイメージングに関する技術開発
可逆的変性カチオン化により可溶化した分泌シグナル付きの前駆体の酵素タンパク質を生細胞内に導入すると、一部が培養上清中に活性構造の成熟型の酵素タンパク質が再分泌されることを酵素活性レベルで確認していたが、その収量はごく微量であった。この効率を改善するため、エンドソームから細胞質内への放出を促進する両親媒性ペプチドの併用条件を検討し、再分泌量が大幅に向上する条件を得た。さらにこの手法で回収された成熟型タンパク質を逆相HPLCを用いて高度に精製し、N末端配列を確認したところ、正しくプロセッシングを受けていることが確認され、翻訳系を伴わないpost-translational経路によるタンパク質の成熟化が可能なことを立証できた。

報告書

(2件)
  • 2009 実績報告書
  • 2008 実績報告書
  • 研究成果

    (11件)

すべて 2010 2009 2008

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (7件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] タンパク質カチオン化技術の工学的応用2010

    • 著者名/発表者名
      二見淳一郎
    • 雑誌名

      ケミカルエンジニアリング 55

      ページ: 223-227

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [雑誌論文] Intracellular delivery of glutathione S-transferase-fused proteins into mammalian cells by polyethylenimine-glutathione conjugates.2008

    • 著者名/発表者名
      Murata H., et al.
    • 雑誌名

      J. Biochemistry 144

      ページ: 447-455

    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Design of cytotoxic ribonucleases by cationization to enhance intracellular protein delivery.2008

    • 著者名/発表者名
      Futami J., Yamada H.
    • 雑誌名

      Cur. Pharm. Biotechnol. 9

      ページ: 180-184

    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 可逆的変性カチオン化法を用いた細胞内導入型転写因子の開発2009

    • 著者名/発表者名
      二見淳一郎, 浅間孝志, 山田秀徳
    • 学会等名
      第9回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      熊本
    • 年月日
      2009-05-20
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] Exploiting protein cationization techniques in future cell therapy2009

    • 著者名/発表者名
      Junichiro Futami
    • 学会等名
      Joint Conference of 10th CTS and 36th JSOPMB
    • 発表場所
      岡山
    • 年月日
      2009-04-20
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] 変性タンパク質の可溶化と細胞内導入を目的とした新規SH基多価カチオン化試薬の合成と解析2008

    • 著者名/発表者名
      穴井祐介ら6名
    • 学会等名
      第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会(BMB2008)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2008-12-12
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] ナノ構造体内部への高密度タンパク質封入に向けたタンパク質カチオン化技術の検討2008

    • 著者名/発表者名
      三井智史ら6名
    • 学会等名
      第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会(BMB2008)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2008-12-11
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] 人工転写因子蛋白質を用いた細胞内導入条件の最適化2008

    • 著者名/発表者名
      浅間孝志ら6名
    • 学会等名
      第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会(BMB2008)
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2008-12-11
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] タンパク質カチオン化技術の医用工学への応用2008

    • 著者名/発表者名
      二見淳一郎
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー : 蛋白質を創る、知る、使う〜蛋白質
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2008-09-29
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] 可逆的カチオン化による細胞から抽出しか変性状態の総タンパク質の可溶化2008

    • 著者名/発表者名
      久良木豪, 二見淳一郎, 山田秀徳
    • 学会等名
      第8回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2008-06-12
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [産業財産権] チオスルホナート化合物、タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤並びに可溶化方法2010

    • 発明者名
      二見淳一郎、山田秀徳、久良木豪、矢木恵一郎
    • 権利者名
      岡山大学
    • 産業財産権番号
      2010-070804
    • 出願年月日
      2010-03-25
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書

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公開日: 2008-04-01   更新日: 2016-04-21  

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