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活性化型TOR変異体を用いた代謝活性化による組換えタンパク質生産能の向上

研究課題

研究課題/領域番号 20658027
研究種目

萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 応用生物化学
研究機関東京大学

研究代表者

前田 達哉  東京大学, 分子細胞生物学研究所, 准教授 (90280627)

研究期間 (年度) 2008
研究課題ステータス 完了 (2008年度)
配分額 *注記
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2008年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
キーワード蛋白質 / バイオテクノロジー / シグナル伝達 / 微生物 / 細胞・組織
研究概要

酵母発現系では、TORC1に対する寄与の大きいTOR1遺伝子に活性化型変異を導入した株を用いた。哺乳類S6キナーゼの酵母ホモログであるSch9のリン酸化がこの株で昂進していることを確認した。強力なGPDプロモーターによりモデルタンパク質β-ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを野生株と活性化型TOR1変異株に導入し、酵素活性を指標に発現量を検討した。バッチ法で培養を続け、対数増殖期、対数増殖後期、定常期における発現量を定量したところ、いずれの条件においても総タンパク質量あたりの発現量に有意な差を認めなかった。一方、菌数あたりの総タンパク質量は、活性化型TOR1変異株の方が一貫して1割程度多かった。このことから、活性化型TOR1変異株を用いることで菌数あたりのタンパク質発現量が改善されることが明らかになった。
哺乳類培養細胞発現系では、最も活性の高かったmTOR SL1+IT変異体を用いた。HEK293細胞に野生型mTOR発現プラスミドもしくはmTOR SLI+IT発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドとを同時に導入し、薬剤耐性を利用してプラスミド導入細胞を選択した後、細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性を指標に発現量を評価したが、有意な差が認められなかった。また、翻訳困難なmRNAのモデルとして、5'非翻訳領域にステムループ構造を挿入したルシフェラーゼ発現プラスミドからの発現量を検討したが、有意な差が認められなかった。さらに、HeLa細胞を用いて野生型mTORもしくはmTORSL1+ITの安定発現株を作製し、同様な解析を行ったが有意な差が認められなかった。これらの結果から、十分な血清を含んだDMEM培地においては、mTORSLI+ITを導入しても組換えタンパク質産生を改善することは困難であることが明らかになった。

報告書

(1件)
  • 2008 実績報告書
  • 研究成果

    (9件)

すべて 2009 2008 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (6件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Evaluation of mTOR function by a gain-of-function approach2009

    • 著者名/発表者名
      大根陽一郎
    • 雑誌名

      Cell Cycle 8

      ページ: 573-579

    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [雑誌論文] Isolation of Hyperactive Mutants of Mammalian Target of Rapamycin2008

    • 著者名/発表者名
      大根陽一郎
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem. 283

      ページ: 31861-31870

    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] アルカリストレス応答性Rimlol経路をRim9-Rim8とDfg16-Rim8融合タンパク質は活性化できる2009

    • 著者名/発表者名
      篠崎翠
    • 学会等名
      酵母遺伝学フォーラム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      2009-09-11
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] 活性亢進型TORを用いた酵母TOR経路制御因子の探索2008

    • 著者名/発表者名
      高原照直
    • 学会等名
      第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド
    • 年月日
      2008-12-10
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] 阻害剤と活性化型TOR変異体を用いた栄養源検知機構の解析2008

    • 著者名/発表者名
      前田達哉
    • 学会等名
      第31回日本分子生物学会年会・第81回目本生化学会大会合同大会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド
    • 年月日
      2008-12-09
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] Delayed activation kinetics ensures the signalling specificity of the hy perosmotic stress-responsive MAP kinase pathway in yeast2008

    • 著者名/発表者名
      前田達哉
    • 学会等名
      8th International Conference on Protein Phosphatases
    • 発表場所
      前橋テレサ
    • 年月日
      2008-11-12
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] 浸透圧刺激直後におけるMAPキナーゼ経路間特異性維持機構2008

    • 著者名/発表者名
      前田達哉
    • 学会等名
      酵母遺伝学フォーラム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      2008-09-10
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [学会発表] アルレカリストレス応答性Rim101経路におけるSnf7の局在変化2008

    • 著者名/発表者名
      林道夫
    • 学会等名
      酵母遺伝学フォーラム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      2008-09-10
    • 関連する報告書
      2008 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://www.iam.u-tokyo.acjp/1KEN/index.html

    • 関連する報告書
      2008 実績報告書

URL: 

公開日: 2008-04-01   更新日: 2016-04-21  

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