リアルタイムPCRの融解曲線を利用した遺伝子突然変異スクリーニング法の開発

• 研究課題/領域番号: 20659157
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 膠原病・アレルギー内科学
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 江口 勝美 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30128160)
• 研究分担者: 井田 弘明 長崎大学, 病院, 講師 (60363496) ; 吉浦 孝一郎 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00304931)
• 研究期間 (年度): 2008 – 2009
• 研究課題ステータス: 完了 (2009年度)
• 配分額: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円); 2009年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2008年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 遺伝子 / 突然変異 / スクリーニング / PCR / 自己炎症 / 融解曲線 / TRAPS

研究概要

遺伝子変異のスクリーニングとして、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)法が用いられてきたが、煩雑なうえに、その検出率はおよそ70%程度であり、スクリーニング法としては一般化されていない。自己炎症疾患に限らず、ミスセンス突然変異は多くの疾患でみられる。ミスセンス突然変異は、ヘテロ接合である。本研究は、高性能となったリアルタイムPCRの融解曲線を利用して、正常人のホモ接合との差を検出し、遺伝子異常のスクリーニングに使用することを目指した。LightCycler 480(Roche社)は高性能であり、ジェノタイピングのハイスループット判定にも利用されていることから、ミスセンス突然変異の検出は可能と考え検討した。
平成20年度からの2年間の研究で、LC Green色素の蛍光強度の融解曲線から突然変異の有無を検出することに成功した。TRAPS患者の遺伝子(T61I変異)を1例混ぜ、LC Green色素の蛍光強度の融解曲線を解析したところ、正常人95例と比較して突然変異の有無が曲線の変化で検出可能であった。この方法は簡便でスピーディー、しかも確実な検出法であった。今後、このシステムを使って、遺伝性の自己炎症疾患(Familial Mediterranean fever(家族性地中海熱;FMF)、TNF receptor-associated periodic syndrome(TRAPS))のスクリーニングが可能となることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Different expression levels of TNF receptors on the rheumatoid synovial macrophages derived from surgery and a synovectomy as detected by a new flow cytometric analysis. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ida H, Aramaki T, Nakamura H, Fujikawa K, Arima K, Tamai M, Kamachi M, Satoh K, Origuchi T, Kawakami A, Furuichi I, Kawabe Y, Eguchi K.
  • 雑誌名: Cytotechnology 60(1-3) ページ: 161-164
  • 査読あり
• [雑誌論文] A significantly impaired natural killer cell activity due to a low activity on a per-cell basis in rheumatoid arthritis. (2009)
  • 著者名/発表者名: Aramaki T, Ida H, Izumi Y, Fujikawa K, Huang M, Arima K, Tamai M, Kamachi M, Nakamura H, Kawakami A, Origuchi T, Matsuoka N, Eguchi K.
  • 雑誌名: Mod Rheumatol 19(3) ページ: 245-252
  • NAID: 10025112851
  • 査読あり
• [雑誌論文] A prediction rule for disease outcome in patients with undifferentiated arthritis using magnetic resonance imaging of the wrists and finger joints and serologic autoantibodies. (2009)
  • 著者名/発表者名: Tamai M, Kawakami A, Uetani M, Takao S, Arima K, Iwamoto N, Fujikawa K, Aramaki T, Kawashiri S, Ichinbse K, Kamachi M, Nakamura H, Origuchi T, Ida H, Aoyagi K, Eguchi K
  • 雑誌名: Arthritis Rheum 61(6) ページ: 772-778
  • 査読あり
• [雑誌論文] Proinflammatory cytokines synergistically enhance the production of chemokine ligand 20(CCL20)from rheumatoid fibroblast-like synovl cells in vitro and serum CCL20 is reduced in vivo by biologic d〓ase-modifying antirheumatic drugs. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashiri S, Kawakami A, Iwamoto N, Fujikawa K, Aramaki T, Tamai M, Arima K, Kamachi M, Yamasaki S, Nakamura H, Tsurumoto T, Kono M, Shindo H, Ida H, Origuchi T, Eguchi K.
  • 雑誌名: J Rheumatol 36(11) ページ: 2397-2402
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic association between the interleukin-2 receptor-alpha gene and mode of onset of type 1 diabetes in the Japanese population. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki E, Awata T, Ikegami H, Kobayashi T, Maruyama T, Nakanishi K, Shimada A, Uga M, Kurihara S, Kawabata Y, Tanaka S, Kanazawa Y, Eguchi K.
  • 雑誌名: J Clin Endocrinol Metab 94(3) ページ: 947-952
  • NAID: 120006984659
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of periodic-fever-syndrome-like disorder with lipodystrophy, myositis, and autoimmune abnormalities. (2008)
  • 著者名/発表者名: Kasagi S, Kawano S, Nakazawa T, Sugino H, KoshibaM, IchinoseK, Ida H, Eguchi K, Kumagai S
  • 雑誌名: Mod Rheumatol 18(2) ページ: 203-207
  • NAID: 10024150509
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRAPSの分子病態. (2008)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美.
  • 雑誌名: 炎症と免疫 16(2) ページ: 139-148
• [雑誌論文] TNF receptor-associated periodic syndrome (TRAPS)の全国疫学調査. (2008)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 一瀬邦弘, 荒牧俊幸, 右田清志, 江口勝美.
  • 雑誌名: 小児科 49(10) ページ: 1349-1356
• [学会発表] TNF receptor-associated periodic syndrome(TRAPS)in Japan. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ida H, Arima K, Kawakami A, Migita K, Eguchi K.
  • 学会等名: 9th World Congress on Inflammation.
  • 発表場所: Tokyo.
• [学会発表] Autoinflammatory syndrome from the aspect of internal medicine. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ida H, Arima K, Eguchi K.
  • 学会等名: 9th World Congress on Inflammation.
  • 発表場所: Tokyo.
• [学会発表] ポストゲノム時代の蛋白機能解析における自己炎症疾患の役割の検討. (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 有馬和彦, 一瀬邦弘, 三嶋博之, 吉浦孝一郎, 江口勝美.
  • 学会等名: 第106回日本内科学会総会・講演会.
  • 発表場所: 東京.
• [学会発表] RAPS全国疫学調査とTRAPSが疑われた不明熱症例の検討(第3報) (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 荒牧俊幸, 有馬和彦, 川尻真也, 岩本直樹, 藤川敬太, 蒲池誠, 玉井慎美, 中村英樹, 折口智樹, 川上純, 右田清志, 江口勝美.
  • 学会等名: 第53回日本リウマチ学会総会・学術集会.
  • 発表場所: 東京.
• [学会発表] ポストゲノム時代の蛋白機能分析における自己炎症囎の役割検討. (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 有馬和彦, 一瀬邦弘, 江口勝美.
  • 学会等名: 第53回日本リウマチ学会総会・学術集会.
  • 発表場所: 東京.
• [学会発表] 周期性関節水腫を認め家族性地中海熱(FMF)が疑われた1例. (2009)
  • 著者名/発表者名: 右田清志, 鳥越雄史, 本川哲, 宮下賜一郎, 和泉泰衛, 小森敦正, 伊東正博, 中村稔, 石橋大海, 安波道郎, 江口勝美.
  • 学会等名: 第38回九州リウマチ学会.
  • 発表場所: 久留米.
• [学会発表] TRAPS全国疫学調査とTRAPSが疑われた不明熱症例の検討. (2008)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美, 他.
  • 学会等名: 第52回 日本リウマチ学会総会・学術集会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 本邦における自己炎症症候群の定義の検討. (2008)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美, 他.
  • 学会等名: 第52回 日本リウマチ学会総会・学術集会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 周期性発熱を来たした筋炎の-症例. (2008)
  • 著者名/発表者名: 笠木伸平, 井田弘明, 江口勝美, 他.
  • 学会等名: 第52回 日本リウマチ学会総会・学術集会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 本邦における自己炎症疾患の現状と定義の検討. (2008)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美, 他.
  • 学会等名: 第52回 日本リウマチ学会総会・学術集会
  • 発表場所: 札幌
• [図書] 日本臨床 (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美.
  • 総ページ数: 11
  • 出版者: 特論 新しい疾患概念「自己炎症症候群」
• [図書] 臨床リウマチ (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明.
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 関節リウマチとNK細胞
• [図書] 感染・炎症・免疫 (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美.
  • 総ページ数: 14
  • 出版者: Autoinflammation(自己炎症)
• [図書] Topics in Atopy (2009)
  • 著者名/発表者名: 井田弘明, 江口勝美.
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 自己炎症疾患(遺伝性周期熱症候群)とは