DT40細胞でニワトリBリンパ球細胞特異的な組換え因子を探索する

• 研究課題/領域番号: 20770147
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 廣田 耕志 京都大学, 大学院・医学研究科, 助教 (00342840)
• 研究期間 (年度): 2008 – 2009
• 研究課題ステータス: 完了 (2009年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2009年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2008年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
• キーワード: 相同組換え / 標的組換え / DT40 / Blm / Exo1 / 組換え促進法 / トリBリンパ球 / 組換え / DT40細胞 / 細胞分化 / transcriptome

研究概要

申請者は、高等真核生物で例外的に標的組換えが効率的に起こることが知られるトリBリンパ球細胞由来DT40細胞株の解析を通じて、標的組換えがどのようなメカニズムでDT40細胞で高いのか?という謎を解き明かし、この知見を動物や植物と行ったこれまで標的組換えが困難であった細胞に応用できるような技術の開発につなげることを目的として研究を行ってきた。当初計画していた実験で、DT40細胞の転写因子(Pax5,Ikarosの2種)のノックアウトによるB細胞系譜からの逸脱に伴う標的組換えの低下や消失は見られなかったことから、DT40と細胞系譜が変質して標的組換えしなくなった細胞間のtranscriptomeアプローチでの比較解析は困難となった。ところが、昨年Blm(ブルーム症候群の原因遺伝子)とExo1(エキソヌクレアーゼ)が協力してDNAの組換えの過程で働くことを示す基礎データが海外の複数のゲループから報告された。これを受けて、我々はDT40細胞でこれらの因子を発現させたときに、ある制限酵素(I-SceI)によって誘導されるタイプの標的組換えが50倍から100倍程度高まることを見いだした(論文2、特許出願済)。さらに、Blm-Exo1による標的組換え率の上昇は、特にミスマッチした配列間の組換えにおいて特に顕著に見られたことから、標的組換えの難しい基質間の組換えに特に有効であることが示唆できた(論文2)

研究成果

• [雑誌論文] Analysis of chromatin Fukuda, T., Yamada, T. and structure at meiotic DSB sites in yeasts. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K., Ohta, K.
  • 雑誌名: Methods in molecular biology Clifton, N. J 557 ページ: 253-266
  • 査読あり
• [雑誌論文] helicase facilitates homologous Bloom DNA recombination between diverged homologous sequences. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi, K., Abdel-Aziz, H.I., Taniguchi, Y., Yamazoe, M., Takeda, S., Hirota, K.
  • 雑誌名: The Journal of biological chemistry 284 ページ: 26360-26367
  • 査読あり
• [雑誌論文] transcription of mRNA-type long and Ohta, K. Cascade non-coding RNAs (mlonRNAs) and local chromatin remodeling. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K.
  • 雑誌名: Epigenetics 4 ページ: 5-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transcription of mRNA-type long and Ohta, K. non-coding RNAs (mlonRNAs) disrupts chromatin array. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K.
  • 雑誌名: Communicative & integrative biology 2 ページ: 25-26
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of chromatin structure at meiotic DSB sites in yeasts. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K., Fukuda, T., Yamada, T., Ohta, K.
  • 雑誌名: Methods in molecular biology Clifton, N.J VOL.557 ページ: 253-266
• [雑誌論文] Bloom DNA helicase facilitates homologous recombination between diverged homologous sequences. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi, K., Abdel-Aziz, H.I., Taniguchi, Y., Yamazoe, M., Takeda, S., Hirota, K.
  • 雑誌名: The Journal of biological chemistry VOL.284 ページ: 26360-26367
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cascade transcription of mRNA-type long non-coding RNAs (mlonRNAs) and local chromatin remodeling (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K., and Ohta, K
  • 雑誌名: Epigenetics 4 ページ: 5-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transcription of mRNA-type long non-coding RNAs (mlonRNAs) disrupts chromatin array (2009)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K., and Ohta, K.
  • 雑誌名: Communicative & Integrative Biology 2 ページ: 25-26
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stepwise chromatin remodelling by a cascade of transcription initiation of non-coding RNAs. (2008)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K. Hoffman, C.S., Shibata, T., Ohta, K., Miyoshi, T., Kugou, K.
  • 雑誌名: Nature 456 ページ: 130-134
  • 査読あり
• [雑誌論文] In-cell Viscosity, Ohta, K. and Measurement Using a Fluorescence Up-conversion Microscope. (2008)
  • 著者名/発表者名: Fujino, T., Hirota, K. Tahara, T.
  • 雑誌名: Chemistry Letters 37 ページ: 1240-1240
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distinct chromatin, Mizuno, K., Shibata, T. and modulators regulate the formation of accessible and repressive chromatin at the fission yeast recombination hotspot ade6-M26. (2008)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K. Ohta, K.
  • 雑誌名: Molecular biology of the cell 19 ページ: 1162-1173
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cdc7-dependent phosphorylation of Mer2 facilitates initiation of yeast meiotic recombination. (2008)
  • 著者名/発表者名: Sasanuma, H., Hirota, K., Kakusho, N., Kugou, K., Kawasaki, Y., Fukuda, T., Shibata, T., Masai, H., Ohta, K.
  • 雑誌名: Genes & development 22 ページ: 398-410
  • 査読あり
• [雑誌論文] Essential roles of Snf21, a Swi2/Snf2 family chromatin remodeler, in fission yeast mitosis. (2008)
  • 著者名/発表者名: Yamada, K., Hirota, K., Shibata, T., Ohta, K. Mizuno, K.
  • 雑誌名: Genes & genetic systems 83 ページ: 361-372
  • NAID: 10023887824
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural and functional analyses of the DMC1-M200V polymorphism found in the human population. (2008)
  • 著者名/発表者名: Hikiba, J., Hirota, K., Ikawa, S., Kinebuchi, T., Sakane, I., Kagawa, W., Takizawa, Y., Yokoyama, S., Mandon-Pepin, B., Nicolas, A., et al.
  • 雑誌名: Nucleic acids research 36 ページ: 4181-4190
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural and functional analyses of the DMC1-M200V Polymorphism found in the human population (2008)
  • 著者名/発表者名: Hikiba, J., Hirota, K. Kagawa. B., Ikara, S., Kinebuchi, T., Sakane, I., Takizawa, Y. Yokoyams, S., Mandan-Pepin, B. Nicolas, A., Kurumizake II.
  • 雑誌名: Nucleic acids research 36 ページ: 4181-4190
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stepwise chromatin remodelling by a cascade of transcription initiation of non-coding RNAs (2008)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K.,Miyoshi, T., Kugou, K., Hoffman, C.S., Shibata, T., and Ohta, K.
  • 雑誌名: Nature 456 ページ: 130-134
  • 査読あり
• [雑誌論文] Essential roles of Snf21, a Swi2/Snf2 family chromatin remodeler, in fission yeast mitosis (2008)
  • 著者名/発表者名: Yamada, K., Hirota, K.,, Mizuno, K., Shibata, T., and Ohta, K.
  • 雑誌名: Genes & genetic systems 83 ページ: 361-372
  • NAID: 10023887824
  • 査読あり
• [学会発表] Chromatin regulation of meiotic recombination and stress-induced gene activation. (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi, T., Kugou, K., Ohta, K. Koji Kikuchi, H. Ismail Abdel-Aziz, Mitsuyoshi Yamazoe, Kouji Hirota
  • 学会等名: International Symposium DNA, Miyoshi
  • 発表場所: Damage Response and Repair
• [学会発表] AGENDA GeneExpression Systems of USA Shunichi Takeda The Bloom DNA helicase facilitates homologous recombination between diverged sequences Presents Epigenetics (2009)
  • 著者名/発表者名: Kouji Hirota
  • 学会等名: Sequencing &SNiPs-2009 Meeting
• [学会発表] Non coding RNAs disrupt chromatin array Transcription of mRNA-type long non-coding RNAs (mlonRNAs) disrupts chromatin array (2009)
  • 著者名/発表者名: Kouji Hirota
  • 学会等名: 内藤コンファレンスNuclear Dynamics and RNA
• [学会発表] The Bloom DNA helicase facilitates homologous recombination between diverged sequences (2009)
  • 著者名/発表者名: Koji Kikuchi, H.Ismail Abdel-Aziz, Mitsuyoshi Yamazoe, Kouji Hirota, Shunichi Takeda
  • 学会等名: International Symposium DNA Damage Response and Repair Mechanisms
  • 発表場所: ギリシャ(クレタ)
• [学会発表] Non coding RNAs disrupt chromatin array (2009)
  • 著者名/発表者名: Kouji Hirota
  • 学会等名: AGENDA GeneExpression Systems of USA Presents Epigenetics, Sequencing &SNiPs-2009 Meeting
  • 発表場所: 米国(ハーバード大学)
• [学会発表] Transcription of mRNA-type long non-coding RNAs (mlonRNAs) disrupts chromatin array (2009)
  • 著者名/発表者名: Kouji Hirota
  • 学会等名: 内藤コンファレンスNuclear Dynamics and RNA
  • 発表場所: 日本(北海道)
• [学会発表] (2008)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K.
  • 学会等名: 分子生物学会(BMB2008)
  • 年月日: 2008-12-12
• [学会発表] Chromatin regulation of meiotic recombination and stress-induced gene activation (2008)
  • 著者名/発表者名: Hirota, K., Miyoshi, T., Kugou, K., Ohta, K.
  • 学会等名: 分子生物学会(BMB2008)
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2008-12-12
• [図書] 細胞工学(基礎の基礎, 1月号) (2010)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、武田俊一
• [図書] 化学と生物(mlonRNA仮説ノンコーディングRNA転写による新規クロマチン構造変化機構, 5月号) (2009)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、太田邦史
• [図書] RNA蛋白質核酸酵素(クロマチン再編成をつうじて遺伝子活性化にかかわるmRNA型長鎖ノンコーディング, No6 vol54) (2009)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、太田邦史
• [図書] 細胞工学12月号(基礎の基礎) (2009)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、武田俊一
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 学研メディカル秀潤社
• [図書] タンパク質核酸酵素 (2009)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、太田邦史
  • 出版者: 共立出版
• [図書] 化学と生物 (2009)
  • 著者名/発表者名: 廣田耕志、太田邦史
  • 出版者: 日本農芸化学会
• [備考]
  • URL: http://rg4.rg.med.kyoto-u.ac.jp/
• [産業財産権] 遺伝的に改変された細胞を製造する方法 (2009)
  • 発明者名: 武田俊一, 廣田耕志
  • 権利者名: 独立行政法人農業生物資源研究所
  • 産業財産権番号: 2009-138902
  • 出願年月日: 2009-06-10