| 研究課題/領域番号 |
20H02905
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
小山内 崇 明治大学, 農学部, 専任准教授 (60512316)
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| 研究分担者 |
久堀 徹 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (40181094)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2022年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2021年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2020年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
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| キーワード | 低酸素応答 / シアノバクテリア / 転写制御 / 微細藻類 / 暗嫌気条件 / 遺伝子発現 / クエン酸回路 / 低酸素 / 発酵 / 酵素 / 糖代謝 / ATP / シグナル伝達 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、低酸素条件下におけるシアノバクテリアの代謝制御機構を明らかにする。申請者は糖異化の制御因子としてRNAポリメラーゼシグマ因子SigEを同定した。低酸素条件下においては、シアノバクテリアの糖異化は大きく促進することがわかっているが、どのように培養液の低酸素の情報が伝達されるかについては未解明である。SigEを過剰発現すると発酵が促進するため、SigEが低酸素条件下で糖異化の制御に働くことは明らかになっているが、どのように酸素の情報がSigEに伝達されるかはわかっていない。本研究では、ATPとタンパク質間相互作用に着目し、低酸素に応答した代謝制御メカニズムを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本研究ではシアノバクテリアなどの微細藻類を用いて、暗嫌気条件における酸素シグナル伝達と、糖代謝の制御機構を解析した。シアノバクテリアの中でも特に使われているSynechocystis sp. PCC 6803（シネコシスティス）を用いて、遺伝子改変や培養の工夫、代謝産物の定量、酵素の生化学などを行なった。また、シアノバクテリアの知見を活かして、真核微細藻類であるユーグレナやシアニディオシゾンメローラ（通称シゾン）の研究も進めた。
シネコシスティスでは、暗嫌気条件にすることで、転写や代謝が大きく変化し、水素やカルボン酸などの生産が行われる。シネコシスティスのクエン酸回路の酵素の１つであるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（citH）の過剰発現株を作製したところ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸などのカルボン酸の生成量が増大した（Iijima et al. 2021 Metab Eng）。
この原因を調べるために、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの３つの酵素を試験管内で組み合わせ、in vitro代謝の再構成を行なった。その結果、pHが酸性側ではクエン酸回路が通常と逆の還元方向に進むことが明らかになった（Ito et al. 2021 Plant J）。このことから、暗嫌気条件でカルボン酸が生成されて細胞質のpHが酸性化すると、クエン酸回路の方向性が変わることが示唆された。
これらの研究は酵素を中心にした代謝制御であるが、2022年度に転写制御も併せて、シアノバクテリアにおける暗嫌気条件のシグナル伝達を明らかにする予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでの研究により、シアノバクテリアの暗嫌気条件における代謝制御機構が明らかになってきた。暗嫌気条件では、シアノバクテリア以外の生物でも代謝の方向性が変わる。しかし、その決定要因は明らかになっていないことが多い。今回の研究によって、３つの酵素を組み合わせる代謝の再構成によって、クエン酸回路の方向性を極める要因が明らかになった（Ito et al. 2021 Plant J）。我々は過去に３つの酵素を個別に生化学解析を行なっており、３つの論文を発表している。しかし、３つの酵素を組み合わせなければ酵素の連続的な反応がわからず、過去の論文からは予想ができない結果を得ることができた。
さらに暗嫌気条件において、遺伝子改変を行うことで、クエン酸回路の方向性を変えることができた。一次代謝は重要であるがゆえに、代謝の方向性をかえることが困難な場合が多い。しかし、シアノバクテリアはは比較的シンプルな制御機構であったため、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの導入が大きく炭素代謝に寄与することができた。
このように、酵素の生化学と遺伝子改変の分子生物学を合わせることで、暗嫌気条件における制御メカニズムが明らかになりつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
暗嫌気条件における代謝酵素の制御や代謝の流れは明らかになってきた。今後は、これに転写の制御メカニズムを合わせるのが目標である。既にRNAポリメラーゼシグマ因子SigEやレスポンスレギュレーター、転写因子などの解析を行うために、FLAGタグなどを導入した遺伝子改変株をシネコシスティスにおいて作製している。これらの株を用いてRNA-sequencing、ChIP-seq解析などを行い、転写制御因子のターゲットを明らかにしていく。
また、シアノバクテリアの知見の一般性を明らかにするため、ユーグレナやシアニディオシゾンメローラを用いて、酵素の生化学や暗嫌気培養を行う。これにより、微細藻類一般で通用する代謝制御メカニズムを明らかにする。既にシアニディオシゾンメローラの酵素の生化学については着手しており、in vitroで活性のでる酵素が多数得られることがわかっている。このため、真核微細藻類としてはシアニディオシゾンメローラをモデルとして、暗嫌気条件における培養実験や、同条件で働く酵素の生化学などを進めていく。
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